From ac0f2ea945de5156944636a72164a67367cf4e25 Mon Sep 17 00:00:00 2001 From: yanzhongsino Date: Fri, 21 Jun 2024 11:02:39 +0800 Subject: [PATCH] Site updated: 2024-06-21 11:02:27 --- 2018/06/04/web_CSS/index.html | 2 +- 2018/06/04/web_html/index.html | 2 +- 2018/06/05/blog_hexo+github/index.html | 2 +- 2018/06/05/web_jquery/index.html | 2 +- 2018/06/11/web_bootstrap/index.html | 2 +- 2018/06/12/web_ES6/index.html | 2 +- 2018/06/12/web_flex/index.html | 2 +- 2018/06/12/web_gulp/index.html | 2 +- 2018/06/14/web_react/index.html | 2 +- .../index.html | 2 +- .../index.html | 2 +- 2021/03/27/bio_experiment/index.html | 2 +- 2021/03/27/bio_taxon_Bauhinia/index.html | 2 +- 2021/04/01/programming_scripts/index.html | 2 +- 2021/04/20/blog_maintenance/index.html | 2 +- 2021/04/20/linux_basics_PATH/index.html | 2 +- .../index.html | 2 +- 2021/06/23/concept_homology/index.html | 2 +- 2021/07/16/concept_crown.and.stem/index.html | 2 +- .../index.html | 2 +- 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tips

  • SEQ_FEAT.BadInternalCharacter
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      关于生信技工 - 657k + 658k | diff --git a/archives/2018/06/index.html b/archives/2018/06/index.html index 7543e37ea6..ad0d24cabd 100644 --- a/archives/2018/06/index.html +++ b/archives/2018/06/index.html @@ -543,7 +543,7 @@

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      生信技工

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      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/11/index.html b/archives/page/11/index.html index 0d790f5499..72ab4debc1 100644 --- a/archives/page/11/index.html +++ b/archives/page/11/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      生信技工

      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/12/index.html b/archives/page/12/index.html index 8325bdcce6..564a2ca503 100644 --- a/archives/page/12/index.html +++ b/archives/page/12/index.html @@ -572,7 +572,7 @@

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      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/3/index.html b/archives/page/3/index.html index 01fbba9a25..5cd2e6089f 100644 --- a/archives/page/3/index.html +++ b/archives/page/3/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

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      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/6/index.html b/archives/page/6/index.html index 1fbf3750f9..0e4acf070a 100644 --- a/archives/page/6/index.html +++ b/archives/page/6/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

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      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/8/index.html b/archives/page/8/index.html index 76a7e34a4e..9119ec659c 100644 --- a/archives/page/8/index.html +++ b/archives/page/8/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      生信技工

      - 657k + 658k | diff --git a/archives/page/9/index.html b/archives/page/9/index.html index a0f81137eb..9c3911d661 100644 --- a/archives/page/9/index.html +++ b/archives/page/9/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      生信技工

      - 657k + 658k | diff --git a/atom.xml b/atom.xml index 7753a7c3aa..978b817930 100644 --- a/atom.xml +++ b/atom.xml @@ -6,7 +6,7 @@ - 2024-06-20T13:17:18.319Z + 2024-06-21T03:01:31.919Z http://example.com/ @@ -21,10 +21,10 @@ http://example.com/2024/06/22/omics_genome.assembly_TGS_Hifiasm_04.operate/ 2024-06-21T16:00:00.000Z - 2024-06-20T13:17:18.319Z + 2024-06-21T03:01:31.919Z - 基于三代HiFi reads用软件Hifiasm对非模式生物进行基因组的从头组装的详细讲解。 + 基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的详细讲解。 @@ -56,10 +56,10 @@ http://example.com/2024/06/21/omics_genome.assembly_TGS_Hifiasm_03.modes/ 2024-06-20T16:00:00.000Z - 2024-06-20T13:17:24.045Z + 2024-06-21T02:35:19.187Z - 基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的多种模式，介绍每种模式的命令。 + 介绍基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的多种模式，以及每种模式的命令。 @@ -93,10 +93,10 @@ http://example.com/2024/06/20/omics_genome.assembly_TGS_Hifiasm_02.algorithm/ 2024-06-19T16:00:00.000Z - 2024-06-20T12:59:22.729Z + 2024-06-21T02:19:01.791Z - 介绍基于HiFi数据组装基因组的软件Hifiasm的算法。 + 介绍基于HiFi数据组装基因组的软件Hifiasm的算法，包括HiFi only模式、有亲本数据的trio-binning模式、Hi-C Integrated assembly模式的算法。 diff --git a/categories/Windows/index.html b/categories/Windows/index.html index 43bbadcb8c..52a4c88bc1 100644 --- a/categories/Windows/index.html +++ b/categories/Windows/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Windows - 657k + 658k | diff --git a/categories/Windows/system/index.html b/categories/Windows/system/index.html index 209f67a555..fca012ad66 100644 --- a/categories/Windows/system/index.html +++ b/categories/Windows/system/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      system - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/concept/index.html b/categories/bio/concept/index.html index ea9c28c0bb..ed8f89916e 100644 --- a/categories/bio/concept/index.html +++ b/categories/bio/concept/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      concept - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/evolution/ancestral-state-reconstruction/index.html b/categories/bio/evolution/ancestral-state-reconstruction/index.html index c128178084..4d7421802d 100644 --- a/categories/bio/evolution/ancestral-state-reconstruction/index.html +++ b/categories/bio/evolution/ancestral-state-reconstruction/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ancestral state reconstruction - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/evolution/index.html b/categories/bio/evolution/index.html index 713c0383b9..4d736cc005 100644 --- a/categories/bio/evolution/index.html +++ b/categories/bio/evolution/index.html @@ -506,7 +506,7 @@

      evolution - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/evolution/selection/index.html b/categories/bio/evolution/selection/index.html index 4c8fa92118..d0aeec99b7 100644 --- a/categories/bio/evolution/selection/index.html +++ b/categories/bio/evolution/selection/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      selection - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/experiment/index.html b/categories/bio/experiment/index.html index aefba27bed..46c6e16887 100644 --- a/categories/bio/experiment/index.html +++ b/categories/bio/experiment/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      experiment - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/genetics/hybridization/index.html b/categories/bio/genetics/hybridization/index.html index fe7f6b2825..9843802a7c 100644 --- a/categories/bio/genetics/hybridization/index.html +++ b/categories/bio/genetics/hybridization/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      hybridization - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/genetics/index.html b/categories/bio/genetics/index.html index e10afd9cba..463b0f0530 100644 --- a/categories/bio/genetics/index.html +++ b/categories/bio/genetics/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      genetics - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/index.html b/categories/bio/index.html index f4dcb9e01b..9bf5e28265 100644 --- a/categories/bio/index.html +++ b/categories/bio/index.html @@ -575,7 +575,7 @@

      bio - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/page/2/index.html b/categories/bio/page/2/index.html index 972f34f491..4d26f7cd6b 100644 --- a/categories/bio/page/2/index.html +++ b/categories/bio/page/2/index.html @@ -526,7 +526,7 @@

      bio - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/plastid/index.html b/categories/bio/plastid/index.html index cd33195c8e..69e9f2eeec 100644 --- a/categories/bio/plastid/index.html +++ b/categories/bio/plastid/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      plastid - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/plot/index.html b/categories/bio/plot/index.html index 9eacd3219b..22f96349ab 100644 --- a/categories/bio/plot/index.html +++ b/categories/bio/plot/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      plot - 657k + 658k | diff --git a/categories/bio/taxon/index.html b/categories/bio/taxon/index.html index 0b9d8fd4e5..bfb9fa3b58 100644 --- a/categories/bio/taxon/index.html +++ b/categories/bio/taxon/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      taxon - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/4dtv/index.html b/categories/bioinfo/4dtv/index.html index 21be777e7e..95a23126d5 100644 --- a/categories/bioinfo/4dtv/index.html +++ b/categories/bioinfo/4dtv/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      4dtv - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/Ks/index.html b/categories/bioinfo/Ks/index.html index f8541c37ab..a24e62f0de 100644 --- a/categories/bioinfo/Ks/index.html +++ b/categories/bioinfo/Ks/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Ks - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/WGD/index.html b/categories/bioinfo/WGD/index.html index dc89e5c85c..b4f80bdc0f 100644 --- a/categories/bioinfo/WGD/index.html +++ b/categories/bioinfo/WGD/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      WGD - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/alignment/align/index.html b/categories/bioinfo/alignment/align/index.html index 2e21d59dfb..72e97074bc 100644 --- a/categories/bioinfo/alignment/align/index.html +++ b/categories/bioinfo/alignment/align/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      align - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/alignment/index.html b/categories/bioinfo/alignment/index.html index 555c3d6fb7..d9d9af3c29 100644 --- a/categories/bioinfo/alignment/index.html +++ b/categories/bioinfo/alignment/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      alignment - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/alignment/trim/index.html b/categories/bioinfo/alignment/trim/index.html index ffc472644c..13a1bcf501 100644 --- a/categories/bioinfo/alignment/trim/index.html +++ b/categories/bioinfo/alignment/trim/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      trim - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/enrichment/index.html b/categories/bioinfo/enrichment/index.html index d34d97e921..744f803acb 100644 --- a/categories/bioinfo/enrichment/index.html +++ b/categories/bioinfo/enrichment/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      enrichment - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/fileformat/fasta/index.html b/categories/bioinfo/fileformat/fasta/index.html index bacf475f33..e16cd436f5 100644 --- a/categories/bioinfo/fileformat/fasta/index.html +++ b/categories/bioinfo/fileformat/fasta/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fasta - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/fileformat/index.html b/categories/bioinfo/fileformat/index.html index 470637d5e3..233b8c3f3d 100644 --- a/categories/bioinfo/fileformat/index.html +++ b/categories/bioinfo/fileformat/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      fileformat - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/fileformat/mitogenome/index.html b/categories/bioinfo/fileformat/mitogenome/index.html index 5504e4db7c..b776bf4363 100644 --- a/categories/bioinfo/fileformat/mitogenome/index.html +++ b/categories/bioinfo/fileformat/mitogenome/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mitogenome - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/gene-family/index.html b/categories/bioinfo/gene-family/index.html index 39de9bae66..bd6e2262c0 100644 --- a/categories/bioinfo/gene-family/index.html +++ b/categories/bioinfo/gene-family/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gene family - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/gene-flow/index.html b/categories/bioinfo/gene-flow/index.html index 42115a30c4..218a5a30f1 100644 --- a/categories/bioinfo/gene-flow/index.html +++ b/categories/bioinfo/gene-flow/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      gene flow - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/index.html b/categories/bioinfo/index.html index 5ada6f8ffe..0663eaa079 100644 --- a/categories/bioinfo/index.html +++ b/categories/bioinfo/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/orthology-inference/index.html b/categories/bioinfo/orthology-inference/index.html index 942f58e522..dcb88f49c1 100644 --- a/categories/bioinfo/orthology-inference/index.html +++ b/categories/bioinfo/orthology-inference/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      orthology inference - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/page/2/index.html b/categories/bioinfo/page/2/index.html index 57713ed384..f69d0f6902 100644 --- a/categories/bioinfo/page/2/index.html +++ b/categories/bioinfo/page/2/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/page/3/index.html b/categories/bioinfo/page/3/index.html index 7605c3bdf0..e4856844e1 100644 --- a/categories/bioinfo/page/3/index.html +++ b/categories/bioinfo/page/3/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/page/4/index.html b/categories/bioinfo/page/4/index.html index a1696b4ef3..805f99f2ef 100644 --- a/categories/bioinfo/page/4/index.html +++ b/categories/bioinfo/page/4/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/page/5/index.html b/categories/bioinfo/page/5/index.html index ba79f603b8..a9af199373 100644 --- a/categories/bioinfo/page/5/index.html +++ b/categories/bioinfo/page/5/index.html @@ -386,7 +386,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/phylogeny/ILS/index.html b/categories/bioinfo/phylogeny/ILS/index.html index 98daa56c30..541fc681d1 100644 --- a/categories/bioinfo/phylogeny/ILS/index.html +++ b/categories/bioinfo/phylogeny/ILS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ILS - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/phylogeny/index.html b/categories/bioinfo/phylogeny/index.html index f29bc2b56e..3f3473f557 100644 --- a/categories/bioinfo/phylogeny/index.html +++ b/categories/bioinfo/phylogeny/index.html @@ -509,7 +509,7 @@

      phylogeny - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/phylogeny/phylogeny-inference/index.html b/categories/bioinfo/phylogeny/phylogeny-inference/index.html index ffcc0d1aa5..fae340ff6d 100644 --- a/categories/bioinfo/phylogeny/phylogeny-inference/index.html +++ b/categories/bioinfo/phylogeny/phylogeny-inference/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogeny inference - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/population-genetics/index.html b/categories/bioinfo/population-genetics/index.html index eb243d64cf..fd005cac76 100644 --- a/categories/bioinfo/population-genetics/index.html +++ b/categories/bioinfo/population-genetics/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      population genetics - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/pseudogene/index.html b/categories/bioinfo/pseudogene/index.html index a9137aeb4c..5e4d4967f6 100644 --- a/categories/bioinfo/pseudogene/index.html +++ b/categories/bioinfo/pseudogene/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pseudogene - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/synteny/index.html b/categories/bioinfo/synteny/index.html index 6201dc5e51..b837751296 100644 --- a/categories/bioinfo/synteny/index.html +++ b/categories/bioinfo/synteny/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      synteny - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/synteny/plot/index.html b/categories/bioinfo/synteny/plot/index.html index de98296a42..8b8662cbac 100644 --- a/categories/bioinfo/synteny/plot/index.html +++ b/categories/bioinfo/synteny/plot/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      plot - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/transcription-factor/index.html b/categories/bioinfo/transcription-factor/index.html index f93631823e..488e74a796 100644 --- a/categories/bioinfo/transcription-factor/index.html +++ b/categories/bioinfo/transcription-factor/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      transcription factor - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/variation/index.html b/categories/bioinfo/variation/index.html index cc8f5c5c06..96d48f057a 100644 --- a/categories/bioinfo/variation/index.html +++ b/categories/bioinfo/variation/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      variation - 657k + 658k | diff --git a/categories/bioinfo/variation/structural-variation/index.html b/categories/bioinfo/variation/structural-variation/index.html index 5fb71752cb..82f50e9fbf 100644 --- a/categories/bioinfo/variation/structural-variation/index.html +++ b/categories/bioinfo/variation/structural-variation/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      structural variation - 657k + 658k | diff --git a/categories/blog/hexo/index.html b/categories/blog/hexo/index.html index 1769ebeda6..2c8bc9de77 100644 --- a/categories/blog/hexo/index.html +++ b/categories/blog/hexo/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      hexo - 657k + 658k | diff --git a/categories/blog/hexo/setting/RSS/index.html b/categories/blog/hexo/setting/RSS/index.html index 1377794fff..7ba4596d29 100644 --- a/categories/blog/hexo/setting/RSS/index.html +++ b/categories/blog/hexo/setting/RSS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RSS - 657k + 658k | diff --git a/categories/blog/hexo/setting/index.html b/categories/blog/hexo/setting/index.html index d0e10c0d3d..de92691793 100644 --- a/categories/blog/hexo/setting/index.html +++ b/categories/blog/hexo/setting/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      setting - 657k + 658k | diff --git a/categories/blog/index.html b/categories/blog/index.html index b384a7a9c4..26a7d61af0 100644 --- a/categories/blog/index.html +++ b/categories/blog/index.html @@ -472,7 +472,7 @@

      blog - 657k + 658k | diff --git a/categories/index.html b/categories/index.html index 8dd29ea4f3..1b868b10e7 100644 --- a/categories/index.html +++ b/categories/index.html @@ -390,7 +390,7 @@

      categories - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/basics/index.html b/categories/linux/basics/index.html index 62a1e3587c..2f3389b6ff 100644 --- a/categories/linux/basics/index.html +++ b/categories/linux/basics/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      basics - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/command/compress/index.html b/categories/linux/command/compress/index.html index 4fd206ab11..c4fba65a5e 100644 --- a/categories/linux/command/compress/index.html +++ b/categories/linux/command/compress/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      compress - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/command/index.html b/categories/linux/command/index.html index cab70f486d..cdf4adf73c 100644 --- a/categories/linux/command/index.html +++ b/categories/linux/command/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      command - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/index.html b/categories/linux/index.html index 868bd90e4e..75646bd33f 100644 --- a/categories/linux/index.html +++ b/categories/linux/index.html @@ -575,7 +575,7 @@

      linux - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/operation-and-maintenance/cache/index.html b/categories/linux/operation-and-maintenance/cache/index.html index 83808a3977..f6cd1aac42 100644 --- a/categories/linux/operation-and-maintenance/cache/index.html +++ b/categories/linux/operation-and-maintenance/cache/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      cache - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/operation-and-maintenance/index.html b/categories/linux/operation-and-maintenance/index.html index 6bfb5ab13d..4ff1637944 100644 --- a/categories/linux/operation-and-maintenance/index.html +++ b/categories/linux/operation-and-maintenance/index.html @@ -489,7 +489,7 @@

      operation and maintenance - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/operation-and-maintenance/log/index.html b/categories/linux/operation-and-maintenance/log/index.html index 6315a3849c..d8cd5b0396 100644 --- a/categories/linux/operation-and-maintenance/log/index.html +++ b/categories/linux/operation-and-maintenance/log/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      log - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/operation-and-maintenance/user/index.html b/categories/linux/operation-and-maintenance/user/index.html index f604d4a75a..62bfde9008 100644 --- a/categories/linux/operation-and-maintenance/user/index.html +++ b/categories/linux/operation-and-maintenance/user/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      user - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/page/2/index.html b/categories/linux/page/2/index.html index a913b72724..373d7f0fdd 100644 --- a/categories/linux/page/2/index.html +++ b/categories/linux/page/2/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      linux - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/shell/index.html b/categories/linux/shell/index.html index 443d51579a..44e6591894 100644 --- a/categories/linux/shell/index.html +++ b/categories/linux/shell/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      shell - 657k + 658k | diff --git a/categories/linux/text-processing/index.html b/categories/linux/text-processing/index.html index e2c6692606..9c5608adcb 100644 --- a/categories/linux/text-processing/index.html +++ b/categories/linux/text-processing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      text processing - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/annotation/index.html b/categories/omics/genome/annotation/index.html index 2dd28b5224..5d7b533996 100644 --- a/categories/omics/genome/annotation/index.html +++ b/categories/omics/genome/annotation/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      annotation - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/genome-assembly/index.html b/categories/omics/genome/genome-assembly/index.html index 36d8577a07..707a0cd92b 100644 --- a/categories/omics/genome/genome-assembly/index.html +++ b/categories/omics/genome/genome-assembly/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      genome assembly - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/genome-sequencing/index.html b/categories/omics/genome/genome-sequencing/index.html index c36135d470..45a910a972 100644 --- a/categories/omics/genome/genome-sequencing/index.html +++ b/categories/omics/genome/genome-sequencing/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      genome sequencing - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/genome-sequencing/third-generation-sequencing/index.html b/categories/omics/genome/genome-sequencing/third-generation-sequencing/index.html index f753f6e520..0c13c4a9eb 100644 --- a/categories/omics/genome/genome-sequencing/third-generation-sequencing/index.html +++ b/categories/omics/genome/genome-sequencing/third-generation-sequencing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      third generation sequencing - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/genome-survey/index.html b/categories/omics/genome/genome-survey/index.html index d9b4a300c2..fb11e66937 100644 --- a/categories/omics/genome/genome-survey/index.html +++ b/categories/omics/genome/genome-survey/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      genome survey - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/index.html b/categories/omics/genome/index.html index 35ee5ce317..eb480ee729 100644 --- a/categories/omics/genome/index.html +++ b/categories/omics/genome/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/page/2/index.html b/categories/omics/genome/page/2/index.html index 88478e48cd..9f28132edd 100644 --- a/categories/omics/genome/page/2/index.html +++ b/categories/omics/genome/page/2/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/page/3/index.html b/categories/omics/genome/page/3/index.html index 5c4f7c4341..477523721c 100644 --- a/categories/omics/genome/page/3/index.html +++ b/categories/omics/genome/page/3/index.html @@ -549,7 +549,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/quality-assessment/index.html b/categories/omics/genome/quality-assessment/index.html index 0ac5c1a401..cc5532d179 100644 --- a/categories/omics/genome/quality-assessment/index.html +++ b/categories/omics/genome/quality-assessment/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      quality assessment - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/genome/quality-assessment/page/2/index.html b/categories/omics/genome/quality-assessment/page/2/index.html index e04046cb1e..20cf0b62c7 100644 --- a/categories/omics/genome/quality-assessment/page/2/index.html +++ b/categories/omics/genome/quality-assessment/page/2/index.html @@ -386,7 +386,7 @@

      quality assessment - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/index.html b/categories/omics/index.html index 71636f3952..14be90b7d7 100644 --- a/categories/omics/index.html +++ b/categories/omics/index.html @@ -572,7 +572,7 @@

      omics - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/organelle/index.html b/categories/omics/organelle/index.html index e11c24e038..ef3b6ec39e 100644 --- a/categories/omics/organelle/index.html +++ b/categories/omics/organelle/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      organelle - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/organelle/recombination/index.html b/categories/omics/organelle/recombination/index.html index 3400b4d0ae..bbf539dd3e 100644 --- a/categories/omics/organelle/recombination/index.html +++ b/categories/omics/organelle/recombination/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      recombination - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/page/2/index.html b/categories/omics/page/2/index.html index f317bf81c1..d66be2d44f 100644 --- a/categories/omics/page/2/index.html +++ b/categories/omics/page/2/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      omics - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/page/3/index.html b/categories/omics/page/3/index.html index 1782bbaf51..335c000eaa 100644 --- a/categories/omics/page/3/index.html +++ b/categories/omics/page/3/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      omics - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/page/4/index.html b/categories/omics/page/4/index.html index b654e0b90d..b5ed1e657a 100644 --- a/categories/omics/page/4/index.html +++ b/categories/omics/page/4/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      omics - 657k + 658k | diff --git a/categories/omics/transcriptome/index.html b/categories/omics/transcriptome/index.html index c6f2687f7e..cb4a12c61e 100644 --- a/categories/omics/transcriptome/index.html +++ b/categories/omics/transcriptome/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      transcriptome - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/R/basic/index.html b/categories/programming/R/basic/index.html index e59e643130..eeb9fc470c 100644 --- a/categories/programming/R/basic/index.html +++ b/categories/programming/R/basic/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      basic - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/R/index.html b/categories/programming/R/index.html index f326c2dd92..1d4465f482 100644 --- a/categories/programming/R/index.html +++ b/categories/programming/R/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      R - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/index.html b/categories/programming/index.html index 6a4c17a84c..e26624141b 100644 --- a/categories/programming/index.html +++ b/categories/programming/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      programming - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/python/index.html b/categories/programming/python/index.html index 228e0a1bf0..fcd03cc8a8 100644 --- a/categories/programming/python/index.html +++ b/categories/programming/python/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      python - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/python/syntax/index.html b/categories/programming/python/syntax/index.html index 3b11e86d51..4e8dd0c84f 100644 --- a/categories/programming/python/syntax/index.html +++ b/categories/programming/python/syntax/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      syntax - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/python/syntax/string/index.html b/categories/programming/python/syntax/string/index.html index 7dfd887e2c..295943038d 100644 --- a/categories/programming/python/syntax/string/index.html +++ b/categories/programming/python/syntax/string/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      string - 657k + 658k | diff --git a/categories/programming/scripts/index.html b/categories/programming/scripts/index.html index 18961657cf..b90f9d3789 100644 --- a/categories/programming/scripts/index.html +++ b/categories/programming/scripts/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      scripts - 657k + 658k | diff --git a/categories/tools/academia/EndNote/index.html b/categories/tools/academia/EndNote/index.html index 0df8c3bbc7..8794a8e83e 100644 --- a/categories/tools/academia/EndNote/index.html +++ b/categories/tools/academia/EndNote/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      EndNote - 657k + 658k | diff --git a/categories/tools/academia/index.html b/categories/tools/academia/index.html index c8a113f0c9..59bed06bda 100644 --- a/categories/tools/academia/index.html +++ b/categories/tools/academia/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      academia - 657k + 658k | diff --git a/categories/tools/index.html b/categories/tools/index.html index aaa5a10bef..ef2b26846d 100644 --- a/categories/tools/index.html +++ b/categories/tools/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      tools - 657k + 658k | diff --git a/categories/web/index.html b/categories/web/index.html index ea4dc198e3..151e7b8e94 100644 --- a/categories/web/index.html +++ b/categories/web/index.html @@ -523,7 +523,7 @@

      web - 657k + 658k | diff --git a/css/main.css b/css/main.css index c3f8044731..93299eea23 100644 --- a/css/main.css +++ b/css/main.css @@ -1197,7 +1197,7 @@ pre .javascript .function { } .links-of-author a::before, .links-of-author span.exturl::before { - background: #ff6267; + background: #ff4ec2; border-radius: 50%; content: ' '; display: inline-block; diff --git a/index.html b/index.html index 9ca80ff811..2b9121c1f9 100644 --- a/index.html +++ b/index.html @@ -243,7 +243,7 @@

      Edited on - + @@ -300,7 +300,7 @@

      -

      基于三代HiFi reads用软件Hifiasm对非模式生物进行基因组的从头组装的详细讲解。

      +

      基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的详细讲解。

      @@ -350,16 +350,10 @@

      Posted on + - + - - - - - Edited on - - @@ -397,7 +391,7 @@

      - 2.4k + 2.6k @@ -415,7 +409,7 @@

      -

      基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的多种模式，介绍每种模式的命令。

      +

      介绍基于三代HiFi reads用软件Hifiasm进行基因组的从头组装的多种模式，以及每种模式的命令。

      @@ -465,10 +459,16 @@

      Posted on - - + + + + + + Edited on + + @@ -524,7 +524,7 @@

      -

      介绍基于HiFi数据组装基因组的软件Hifiasm的算法。

      +

      介绍基于HiFi数据组装基因组的软件Hifiasm的算法，包括HiFi only模式、有亲本数据的trio-binning模式、Hi-C Integrated assembly模式的算法。

      @@ -1468,7 +1468,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/10/index.html b/page/10/index.html index 0c8e8c3df6..23db4aeb59 100644 --- a/page/10/index.html +++ b/page/10/index.html @@ -1462,7 +1462,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/11/index.html b/page/11/index.html index f43bb529a0..573e79e5be 100644 --- a/page/11/index.html +++ b/page/11/index.html @@ -1462,7 +1462,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/12/index.html b/page/12/index.html index 3e04116ce4..c929bb39a3 100644 --- a/page/12/index.html +++ b/page/12/index.html @@ -1426,7 +1426,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/13/index.html b/page/13/index.html index 5e8353e902..666e900e89 100644 --- a/page/13/index.html +++ b/page/13/index.html @@ -558,7 +558,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/2/index.html b/page/2/index.html index dd39f239bf..40560ee402 100644 --- a/page/2/index.html +++ b/page/2/index.html @@ -1474,7 +1474,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/3/index.html b/page/3/index.html index 6838cb29ff..07fe720f3f 100644 --- a/page/3/index.html +++ b/page/3/index.html @@ -1476,7 +1476,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/4/index.html b/page/4/index.html index e0ed4abf2f..af95679664 100644 --- a/page/4/index.html +++ b/page/4/index.html @@ -1458,7 +1458,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/5/index.html b/page/5/index.html index 88b4d2d796..a2eb3016cf 100644 --- a/page/5/index.html +++ b/page/5/index.html @@ -1470,7 +1470,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/6/index.html b/page/6/index.html index f50ab8bc4c..49b1c3eb52 100644 --- a/page/6/index.html +++ b/page/6/index.html @@ -1486,7 +1486,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/7/index.html b/page/7/index.html index d7cfaee729..20777a351b 100644 --- a/page/7/index.html +++ b/page/7/index.html @@ -1474,7 +1474,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/8/index.html b/page/8/index.html index 06197e73c3..0ce841b4ab 100644 --- a/page/8/index.html +++ b/page/8/index.html @@ -1458,7 +1458,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/page/9/index.html b/page/9/index.html index c535ee9353..7b2f36ae45 100644 --- a/page/9/index.html +++ b/page/9/index.html @@ -1458,7 +1458,7 @@

      - 657k + 658k | diff --git a/search.xml b/search.xml index c6924408b9..0fe3a7006b 100644 --- a/search.xml +++ b/search.xml @@ -199,147 +199,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 system - - 分子生物学实验 - /2021/03/27/bio_experiment/ -

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      常用PCR参数

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      1. PCR Easy tag 体系(20μl)
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      • ddH2O 12.2μl
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      • 10Xbuffer 2.0μl
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      • dNTP 1.6μl
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      • Easy tag酶 0.2μl
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      • DNA 2μl
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      • Primer-F 1μl
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      • Primer-R 1μl
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      1. PCR常用程序
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      • 预热 94℃ 10min
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      以下步骤循环28-34次

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      • 解螺旋94℃ 0.5-1min
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      循环结束继续以下步骤

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      -]]> - - bio - experiment - - - experiment - molecular experiment - PCR - - - - 正交和反交在遗传学中的应用 - /2024/06/18/bio_genetics_hybridization_reciprocal.cross/ -
      - -

      1. 正交和反交

        -
      • 正反交（reciprocal cross）又称为互交，是指两个具有不同基因型的亲本杂交时配置父本和母本的两种方式。
        • -
      • 正反交是相对而言。如以A（♀）×B（♂）为正交，则B（♀）×A（♂）为反交。
        • -
      -

      2. 正交和反交在遗传学中的应用

      2.1. 判断某对性状是细胞核遗传和细胞质遗传

        -
      1. 细胞核遗传
        2. -
      -
        -
      • 由细胞核中的基因控制的遗传，称为细胞核遗传。由孟德尔的遗传试验得知：在细胞核遗传中，正反交的结果是一样的。
        • -
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        -
      1. 细胞质遗传
        2. -
      -
        -
      • 由线粒体或叶绿体（植物）中的基因控制的遗传，称为细胞质遗传。由紫茉莉质体的遗传实验得知：在细胞质遗传中，正反交的结果是不一样的。
        • -
      -
        -
      1. 判断方式
        2. -
      -
        -
      • 若正交和反交产生的F1的性状表现都与母本相同，则为细胞质遗传；若正交与反交产生的F1的性状表现都与父本相关，则为细胞核遗传。
        • -
      -

      2.2. 如果性状是细胞核遗传，判断控制性状的基因在常染色体（或性染色体同源区段）上还是性染色体非同源区段上

        -
      1. 常染色体（或性染色体同源区段）上的基因控制的遗传
        2. -
      -
        -
      • 常染色体上的基因控制的遗传，无论正交、反交其后代的基因型、表现型及其比例都是相同的，与性别无关。
        • -
      • 性染色体的同源区段上的基因控制的遗传与常染色体类似，所以要注意。
        • -
      -
        -
      1. 性染色体上的基因控制的遗传
        2. -
      -
        -
      • 对性别决定的生物来讲，由于两种性染色体中存在非同源部分。
        • -
      • 因此，正反交后代的基因型比例存在不同。
        • -
      -
        -
      1. 判断方式
        2. -
      -
        -
      • 若正交和反交产生的F1的性状表现比例一致，则控制性状的基因在常染色体上或者在性染色体同源区段上；若正交与反交产生的F1的性状比例不一致，则控制性状的基因在性染色体非同源区段上。
        • -
      -

      2.3. 判断植物果实的某种性状是由子房壁（珠被）发育而来的还是由受精胚珠发育而来的

      果实的部分性状是子房壁（属于母本）发育而来，部分性状是由受精胚珠（属于子代）发育而来。

      -
        -
      1. 子房壁（珠被）发育
        2. -
      -
        -
      • 被子植物雌蕊子房壁会发育而形成的果实中（果肉）部分的大小、色泽、形态等特征。
        • -
      • 这些特征完全由母本的遗传物质决定，与父本的遗传物质无任何关系。
        • -
      • 因此，被子植物在进行正反交时，果实的性状完全表现为母本的性状，但这与细胞质遗传有着本质的区别。
        • -
      -
        -
      1. 判断方式
        2. -
      -
        -
      • 方法：用显性雄性个体与隐性雌性个体进行杂交（正交），再用隐性雄性个体与显性雌性个体进行杂交（反交）
        • -
      • 结果与结论：若性状完全与母本一致，即正交的性状为隐性性状而反交的性状为显性性状，则该性状是由子房壁（珠被）发育而来的。若性状表现出F1代特征，即全为显性性状，则该性状是由受精胚珠发育而来的。
        • -
      -
        -
      1. 性状例子
        已知甜玉米与非甜玉米为一对相对性状，且甜玉米对非甜玉米为隐性。探究玉米子粒中决定口味的部分是来自子房壁的发育，还是来自受精胚珠的发育。
        2. -
      -

      3. reference

        -
      1. wiki：互交：https://zh.wikipedia.org/wiki/%E4%BA%92%E4%BA%A4
        2. -
      2. wiki：reciprocal cross：https://en.wikipedia.org/wiki/Reciprocal_cross
        3. -
      3. 百度百科：正反交：https://baike.baidu.com/item/%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4/5883018#:~:text=%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4_%E7%99%BE%E5%BA%A6%E7%99%BE%E7%A7%91&text=%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4%EF%BC%88reciprocal%20crosses,%EF%BC%88%E2%99%82%EF%BC%89%E4%B8%BA%E5%8F%8D%E4%BA%A4%E3%80%82
        4. -
      4. 巧用正反交解决遗传中的问题：https://res.tongyi.com/resources/article/student/others/200803zt-xf-zw/200803zt/xf/gz/sw/XF1W0347.htm
        5. -
      5. 正交与反交在遗传学解题中的应用：https://blog.sina.com.cn/s/blog_b30a6c020101hmua.html
        6. -
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      + + +

      常用PCR参数

        +
      1. PCR Easy tag 体系(20μl)
        2. +
      +
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      • ddH2O 12.2μl
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      • 10Xbuffer 2.0μl
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      • dNTP 1.6μl
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      • Easy tag酶 0.2μl
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      • Primer-F 1μl
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      • Primer-R 1μl
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      1. PCR常用程序
        2. +
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      • 预热 94℃ 10min
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      以下步骤循环28-34次

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      • 解螺旋94℃ 0.5-1min
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      • 退火53℃ 30-45seconds
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      循环结束继续以下步骤

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      - + 正交和反交在遗传学中的应用 + /2024/06/18/bio_genetics_hybridization_reciprocal.cross/ +

      -

      1. 热图(heatmap)

      热图(heatmap)是在两个维度用不同颜色展示一种现象的大小的一种数据可视化技术。有两种本质上不同的热图，网格热图(grid heatmap)和空间热图(spatial heatmap)。

      -
        -
      1. 网格热图(grid heatmap)
        网格热图用不同颜色代表不同数值的二维矩形图，同时两个维度还可以通过颜色进行聚类。
        2. +

        1. 正交和反交

          +
        • 正反交（reciprocal cross）又称为互交，是指两个具有不同基因型的亲本杂交时配置父本和母本的两种方式。
          • +
        • 正反交是相对而言。如以A（♀）×B（♂）为正交，则B（♀）×A（♂）为反交。
          • +
        +

        2. 正交和反交在遗传学中的应用

        2.1. 判断某对性状是细胞核遗传和细胞质遗传

          +
        1. 细胞核遗传
        -

        比如不同物种在不同基因上的表达水平。

        - - -

        Figure 1. heatmap集群热图

        +
          +
        • 由细胞核中的基因控制的遗传，称为细胞核遗传。由孟德尔的遗传试验得知：在细胞核遗传中，正反交的结果是一样的。
          • +
          -
        1. 空间热图(spatial heatmap)
          空间热图将空间现象的大小通过颜色投射到地图上。
          2. +
        2. 细胞质遗传
        -

        比如世界的温度分布图。

        - - -

        Figure 2. heatmap空间热图

        +
          +
        • 由线粒体或叶绿体（植物）中的基因控制的遗传，称为细胞质遗传。由紫茉莉质体的遗传实验得知：在细胞质遗传中，正反交的结果是不一样的。
          • +
          -
        1. 等值线图(choropleth map)
          此外，还有与空间热图相似的，常用于地理上可视化的等值线图(choropleth map)。等值线图按照地理边界分组，如国家，州，省或者人为划分的植被区和气候区等，常常具有不规则边界。
          2. +
        2. 判断方式
        -

        比如美国各州人口密度图。

        - - -

        Figure 3. choropleth map等值线图

        -

        2. 绘制热图

        这篇文章记录的是绘制网格热图的方法，包括常用的R包pheatmap和ggplot2。

        -

        2.1. pheatmap包

          -
        1. 输入数据(gene_expression.txt)的格式
          2. +
            +
          • 若正交和反交产生的F1的性状表现都与母本相同，则为细胞质遗传；若正交与反交产生的F1的性状表现都与父本相关，则为细胞核遗传。
            • +
          +

          2.2. 如果性状是细胞核遗传，判断控制性状的基因在常染色体（或性染色体同源区段）上还是性染色体非同源区段上

            +
          1. 常染色体（或性染色体同源区段）上的基因控制的遗传
            -
          • 第一行标题行
            • -
          • 第一列是基因名称
            • -
          • 第二列是数值（比如表达量）
            • -
          • 可以是一组数据，则只有第二列；也可以是多组数据，依次是第二列及之后列。
            • +
          • 常染色体上的基因控制的遗传，无论正交、反交其后代的基因型、表现型及其比例都是相同的，与性别无关。
            • +
          • 性染色体的同源区段上的基因控制的遗传与常染色体类似，所以要注意。
          -
          tf ath_1 ath_2 egr_1 egr_2
          AP2 1.0043 0 0.942273 0
          ARF 1.20516 1.58619 1.13073 1.48129
          -
            -

          1. 读取数据和聚类

            -
            df<-read.table("gene_expression.txt",sep= " ", header = T,row.names = 1)
            df_row <- hclust(dist(df)) #对行聚类
            df <- df[df_row$order,] #按行聚类结果排序
            df_column <- hclust(dist(t(df))) #对列聚类
            df <- df[,df_column$order] #按列聚类结果排序
            -
            2. -

          2. 绘制热图

            -
            BiocManager::install("pheatmap")
            library(pheatmap)
            pheatmap(mat=df,color = colorRampPalette(c("lightgreen", "yellow","orange","red"))(20),legend_breaks = c(1:4), legend_labels = c("1.0","2.0","3.0","4.0"), border_color="white",treeheight_row = 50, treeheight_col = 8, display_numbers = TRUE, number_color = "black",main = "TF heatmap",cellwidth = 50, cellheight = 10)
            # 其中color = colorRampPalette(c("lightgreen", "yellow","orange","red"))(20) #设置颜色渐变，值从低到高依次是浅绿色-黄色-橙色-红色，共20个颜色。
            -
            3. -

          3. 更完整的pheatmap参数

            -
            4. +
          4. 性染色体上的基因控制的遗传
          -
          pheatmap(mat = mat, # 表达矩阵
                         scale = "row", # 数据标准化方法（col/row/none）
                         clustering_method = "complete", # 聚类方法（ward/ward.D/ward.D2/single/complete/average/mcquitty/median/centroid）
                         clustering_distance_rows = "euclidean", # 行距离度量（correlation/euclidean）
                         clustering_distance_cols = "euclidean", # 列距离度量（correlation/euclidean）
                         cluster_cols = TRUE,cluster_rows = TRUE, # 行/列聚类（TRUE/FALSE）
                         treeheight_col = 35,treeheight_row = 45, # 行/列聚类树高度
                         annotation_col = coldata, # 分组矩阵（可不提供）
                         cutree_cols = 2, # 列等分为2
                         cutree_rows = 2, # 行等分为2
                         show_colnames = TRUE,show_rownames = TRUE, # 是否显示行/列标签（TRUE/FALSE）
                         fontsize_row = 7.5,fontsize_col = 7.5, # 横/纵轴标签大小
                         color = colorRampPalette(colors = c("blue","white","red"))(100), # 颜色设置
                         main = paste("Cluster Heatmap of",nrow(mat),"features",sep = " "), # 标题设置
                         filename = "heatmap.pdf", # 输出文件设置
                         width = 7,height = 7) # 图片长宽设置
          +
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          • 对性别决定的生物来讲，由于两种性染色体中存在非同源部分。
            • +
          • 因此，正反交后代的基因型比例存在不同。
            • +
          +
            +
          1. 判断方式
            2. +
          +
            +
          • 若正交和反交产生的F1的性状表现比例一致，则控制性状的基因在常染色体上或者在性染色体同源区段上；若正交与反交产生的F1的性状比例不一致，则控制性状的基因在性染色体非同源区段上。
            • +
          +

          2.3. 判断植物果实的某种性状是由子房壁（珠被）发育而来的还是由受精胚珠发育而来的

          果实的部分性状是子房壁（属于母本）发育而来，部分性状是由受精胚珠（属于子代）发育而来。

          +
            +
          1. 子房壁（珠被）发育
            2. +
          +
            +
          • 被子植物雌蕊子房壁会发育而形成的果实中（果肉）部分的大小、色泽、形态等特征。
            • +
          • 这些特征完全由母本的遗传物质决定，与父本的遗传物质无任何关系。
            • +
          • 因此，被子植物在进行正反交时，果实的性状完全表现为母本的性状，但这与细胞质遗传有着本质的区别。
            • +
          +
            +
          1. 判断方式
            2. +
          +
            +
          • 方法：用显性雄性个体与隐性雌性个体进行杂交（正交），再用隐性雄性个体与显性雌性个体进行杂交（反交）
            • +
          • 结果与结论：若性状完全与母本一致，即正交的性状为隐性性状而反交的性状为显性性状，则该性状是由子房壁（珠被）发育而来的。若性状表现出F1代特征，即全为显性性状，则该性状是由受精胚珠发育而来的。
            • +
          +
            +
          1. 性状例子
            已知甜玉米与非甜玉米为一对相对性状，且甜玉米对非甜玉米为隐性。探究玉米子粒中决定口味的部分是来自子房壁的发育，还是来自受精胚珠的发育。
            2. +
          +

          3. reference

            +
          1. wiki：互交：https://zh.wikipedia.org/wiki/%E4%BA%92%E4%BA%A4
            2. +
          2. wiki：reciprocal cross：https://en.wikipedia.org/wiki/Reciprocal_cross
            3. +
          3. 百度百科：正反交：https://baike.baidu.com/item/%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4/5883018#:~:text=%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4_%E7%99%BE%E5%BA%A6%E7%99%BE%E7%A7%91&text=%E6%AD%A3%E5%8F%8D%E4%BA%A4%EF%BC%88reciprocal%20crosses,%EF%BC%88%E2%99%82%EF%BC%89%E4%B8%BA%E5%8F%8D%E4%BA%A4%E3%80%82
            4. +
          4. 巧用正反交解决遗传中的问题：https://res.tongyi.com/resources/article/student/others/200803zt-xf-zw/200803zt/xf/gz/sw/XF1W0347.htm
            5. +
          5. 正交与反交在遗传学解题中的应用：https://blog.sina.com.cn/s/blog_b30a6c020101hmua.html
            6. +
          +
          +
            +
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            • +
          • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
            • +
          +]]> + + bio + genetics + hybridization + + + bio + reciprocal cross + hybridization + + + + 热图的简介和绘制 + /2022/11/06/bio_plot_heatmap/ +
      + + +

      1. 热图(heatmap)

      热图(heatmap)是在两个维度用不同颜色展示一种现象的大小的一种数据可视化技术。有两种本质上不同的热图，网格热图(grid heatmap)和空间热图(spatial heatmap)。

      +
        +
      1. 网格热图(grid heatmap)
        网格热图用不同颜色代表不同数值的二维矩形图，同时两个维度还可以通过颜色进行聚类。
        2. +
      +

      比如不同物种在不同基因上的表达水平。

      + + +

      Figure 1. heatmap集群热图

      +
        +
      1. 空间热图(spatial heatmap)
        空间热图将空间现象的大小通过颜色投射到地图上。
        2. +
      +

      比如世界的温度分布图。

      + + +

      Figure 2. heatmap空间热图

      +
        +
      1. 等值线图(choropleth map)
        此外，还有与空间热图相似的，常用于地理上可视化的等值线图(choropleth map)。等值线图按照地理边界分组，如国家，州，省或者人为划分的植被区和气候区等，常常具有不规则边界。
        2. +
      +

      比如美国各州人口密度图。

      + + +

      Figure 3. choropleth map等值线图

      +

      2. 绘制热图

      这篇文章记录的是绘制网格热图的方法，包括常用的R包pheatmap和ggplot2。

      +

      2.1. pheatmap包

        +
      1. 输入数据(gene_expression.txt)的格式
        2. +
      +
        +
      • 第一行标题行
        • +
      • 第一列是基因名称
        • +
      • 第二列是数值（比如表达量）
        • +
      • 可以是一组数据，则只有第二列；也可以是多组数据，依次是第二列及之后列。
        • +
      +
      tf ath_1 ath_2 egr_1 egr_2
      AP2 1.0043 0 0.942273 0
      ARF 1.20516 1.58619 1.13073 1.48129
      + +
        +

      1. 读取数据和聚类

        +
        df<-read.table("gene_expression.txt",sep= " ", header = T,row.names = 1)
        df_row <- hclust(dist(df)) #对行聚类
        df <- df[df_row$order,] #按行聚类结果排序
        df_column <- hclust(dist(t(df))) #对列聚类
        df <- df[,df_column$order] #按列聚类结果排序
        +
        2. +

      2. 绘制热图

        +
        BiocManager::install("pheatmap")
        library(pheatmap)
        pheatmap(mat=df,color = colorRampPalette(c("lightgreen", "yellow","orange","red"))(20),legend_breaks = c(1:4), legend_labels = c("1.0","2.0","3.0","4.0"), border_color="white",treeheight_row = 50, treeheight_col = 8, display_numbers = TRUE, number_color = "black",main = "TF heatmap",cellwidth = 50, cellheight = 10)
        # 其中color = colorRampPalette(c("lightgreen", "yellow","orange","red"))(20) #设置颜色渐变，值从低到高依次是浅绿色-黄色-橙色-红色，共20个颜色。
        +
        3. +

      3. 更完整的pheatmap参数

        +
        4. +
      +
      pheatmap(mat = mat, # 表达矩阵
                     scale = "row", # 数据标准化方法（col/row/none）
                     clustering_method = "complete", # 聚类方法（ward/ward.D/ward.D2/single/complete/average/mcquitty/median/centroid）
                     clustering_distance_rows = "euclidean", # 行距离度量（correlation/euclidean）
                     clustering_distance_cols = "euclidean", # 列距离度量（correlation/euclidean）
                     cluster_cols = TRUE,cluster_rows = TRUE, # 行/列聚类（TRUE/FALSE）
                     treeheight_col = 35,treeheight_row = 45, # 行/列聚类树高度
                     annotation_col = coldata, # 分组矩阵（可不提供）
                     cutree_cols = 2, # 列等分为2
                     cutree_rows = 2, # 行等分为2
                     show_colnames = TRUE,show_rownames = TRUE, # 是否显示行/列标签（TRUE/FALSE）
                     fontsize_row = 7.5,fontsize_col = 7.5, # 横/纵轴标签大小
                     color = colorRampPalette(colors = c("blue","white","red"))(100), # 颜色设置
                     main = paste("Cluster Heatmap of",nrow(mat),"features",sep = " "), # 标题设置
                     filename = "heatmap.pdf", # 输出文件设置
                     width = 7,height = 7) # 图片长宽设置

      2.2. ggplot2包

      这个我还没试过，把https://zhuanlan.zhihu.com/p/464964887提到的代码摘抄在这。

      # Step1 根据实际情况确定是否对数据进行标准化
      data <- scale(data,center = TRUE,scale = TRUE)

      # Step2 数据重排及格式转换
      row_clust <- hclust(dist(mat,method = "euclidean"),method = "complete") # 行(特征)聚类
      rowInd <- row_clust$order # 行(特征)的顺序
      col_clust <- hclust(dist(t(mat),method = "euclidean"),method = "complete") # 矩阵转置,列(样本)聚类
      colInd <- col_clust$order # 列(样本)的顺序
      mat <- mat[rowInd,colInd] # 将数据按照聚类结果重新排序
      melt_mat <- melt(mat) # 融合数据,使之适用ggplot
      colnames(melt_mat) <- c("Feature","Sample","Value")

      # 聚类方法：ward.D/ward.D2/single/complete/average/mcquitty/median/centroid（后两种可能会出现边为负的情况）
      # 距离度量：euclidean/maximum/manhattan/canberra/binary/minkowski

      # Step3 绘制聚类树
      h <- ggtree(row_clust,layout = "rectangular",branch.length = "none") # 行聚类树
      v <- ggtree(col_clust)+layout_dendrogram() # 列聚类树

      # Step4 绘制热图
      p.ggplot <- ggplot(data = mat_new,aes(x = Sample,y = Feature,fill = Value))+
        geom_tile()+
        theme_minimal()+
        scale_fill_gradient2(low = "blue",high = "red",mid = "white",name = "Expression")+
        scale_y_discrete(position = "right")+
        labs(x = "",y = "")+
        theme(axis.title = element_text(size = 15),
              axis.text.y = element_text(size = 10),axis.text.x = element_text(angle = 90,size = 11),
              legend.title = element_text(size = 15),legend.text = element_text(size = 11))

      # Step5 绘制分组信息条形图（可不提供）
      p.group <- ggplot(data = coldata,aes(x = Sample,y = Condition,fill = Group))+
        geom_tile()+
        scale_y_discrete(position = "right")+
        theme_minimal()+
        theme(axis.text = element_blank(),axis.title = element_blank(),
              legend.title = element_text(size = 15),legend.text = element_text(size = 11))+
        labs(fill = "Group")

      # Step6 拼接图
      p.all <- p.ggplot %>% insert_left(h,width = 0.15) %>% insert_top(p.group,height = 0.05) %>% insert_top(v,height = 0.1)
      @@ -1365,63 +1365,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 OrthoFinder2 - - 用MAFFT在现有多序列比对中添加新序列 - /2023/11/16/bioinfo_alignment_align_mafft_add/ - - - -

      1. MAFFT简介

      MAFFT是基于渐进式比对的算法，用于进行多序列比对(Multiple Sequence Alignment,MSA)。由于比对速度快，常用于组学数据的比对。

      -

      MAFFT网页版有一个功能（–add），即向现有的多序列比对中添加新的序列，这在新增数据时非常有用。

      -

      2. MAFFT的–add功能

      MAFFT的–add功能的网页：https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/add.html

      -

      2.1. –add功能的三个模块

      根据新增序列和现有多序列比对(MSA)的相对长度，分别选用–add功能的三个模块：

      -
        -
      1. –add：align full length sequences to an MSA. 新增序列与现有MSA长度相当时，选–add模块。
        2. -
      2. –addfragments：align fragment sequences to an MSA. 新增序列短于现有MSA时，选–addfragments模块。
        3. -
      3. –addlong：align long sequences to a short MSA. 新增序列长于现有MSA时，选–addlong模块。
        4. -
      -

      3. MAFFT网页版的–add用法

      在网页https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/add.html上选择模块，然后上传现有MSA和新增序列，选择参数，即可获得比对结果。

      -

      3.1. 基本参数

        -
      1. Allow unusual symbols：是否允许不明确字符。
        2. -
      2. UPPERCASE/lowercase：输出的比对文件的字母大小写是否与输入文件一致。
        3. -
      3. Direction of nucleotide sequences：是否根据第一条序列调整剩余序列的方向。
        4. -
      4. Output order：输出比对文件的序列顺序。
        5. -
      5. Sequence title：输出比对文件的序列名称是否与输入文件一致。

        3.2. 高级参数

        最常用的是第一个参数，是否要保持输出MSA的长度。
        6. -
      6. Keep alignment length：是否保持输出的比对的长度与输入的现有MSA长度一致，如果选择这个选项，则会把新增序列的insertions删除以保持长度不变。
        7. -
      7. Strategy：默认选择Auto
        8. -
      8. Progressive methods：包括FFT-NS-2,G-INS-1,L-INS-1三个选项。
        9. -
      9. Iterative refinement methods：包括FFT-NS-i,G-INS-i,L-INS-i三个选项。
        10. -
      10. 对核苷酸/氨基酸序列的分数矩阵和gap处理等参数。
        11. -
      -

      3.3. 结果

      提交之后，在网页中可以看到比对结果，并可以下载fasta/clustal格式的比对结果，也可以转化成phylip/nexus/msf/gcg等格式。

      -

      还可以点击Refine dataset进入编辑界面，对比对结果进行进一步的编辑，比如对指定序列进行反向互补操作，保留或删除指定序列。

      -

      4. MAFFT命令行版的–add用法

      命令行版也可以使用–add功能，具体参数参考：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/addsequences.html

      -

      5. MAFFT的merge功能

      MAFFT还有一个merge模块，网页版：https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/merge.html

      -

      merge模块用于合并两个或更多已比对好的sub MSAs。当假定这些sub MSAs在系统发育关系上是各自独立为一单系时，即系统树上各自不重叠时，可使用merge模块。如果系统发育关系不独立，则推荐使用–add模块。

      -

      6. references

        -
      1. https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/
        2. -
      -
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      -]]>       - - bioinfo - alignment - align - - - alignment - Multiple Sequence Alignment - MSA - sequence alignment - MAFFT - add - merge - -       介绍序列比对(Sequence Alignment) /2021/09/06/bioinfo_alignment_align_intro/ @@ -1662,10 +1605,10 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 Multiple Sequence Alignment MSA sequence alignment - MAFFT trimming Clustal MUSCLE + MAFFT PRANK Gblocks trimAl @@ -1766,6 +1709,63 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 PAL2NAL + + 用MAFFT在现有多序列比对中添加新序列 + /2023/11/16/bioinfo_alignment_align_mafft_add/ + + + +

      1. MAFFT简介

      MAFFT是基于渐进式比对的算法，用于进行多序列比对(Multiple Sequence Alignment,MSA)。由于比对速度快，常用于组学数据的比对。

      +

      MAFFT网页版有一个功能（–add），即向现有的多序列比对中添加新的序列，这在新增数据时非常有用。

      +

      2. MAFFT的–add功能

      MAFFT的–add功能的网页：https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/add.html

      +

      2.1. –add功能的三个模块

      根据新增序列和现有多序列比对(MSA)的相对长度，分别选用–add功能的三个模块：

      +
        +
      1. –add：align full length sequences to an MSA. 新增序列与现有MSA长度相当时，选–add模块。
        2. +
      2. –addfragments：align fragment sequences to an MSA. 新增序列短于现有MSA时，选–addfragments模块。
        3. +
      3. –addlong：align long sequences to a short MSA. 新增序列长于现有MSA时，选–addlong模块。
        4. +
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      3. MAFFT网页版的–add用法

      在网页https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/add.html上选择模块，然后上传现有MSA和新增序列，选择参数，即可获得比对结果。

      +

      3.1. 基本参数

        +
      1. Allow unusual symbols：是否允许不明确字符。
        2. +
      2. UPPERCASE/lowercase：输出的比对文件的字母大小写是否与输入文件一致。
        3. +
      3. Direction of nucleotide sequences：是否根据第一条序列调整剩余序列的方向。
        4. +
      4. Output order：输出比对文件的序列顺序。
        5. +
      5. Sequence title：输出比对文件的序列名称是否与输入文件一致。

        3.2. 高级参数

        最常用的是第一个参数，是否要保持输出MSA的长度。
        6. +
      6. Keep alignment length：是否保持输出的比对的长度与输入的现有MSA长度一致，如果选择这个选项，则会把新增序列的insertions删除以保持长度不变。
        7. +
      7. Strategy：默认选择Auto
        8. +
      8. Progressive methods：包括FFT-NS-2,G-INS-1,L-INS-1三个选项。
        9. +
      9. Iterative refinement methods：包括FFT-NS-i,G-INS-i,L-INS-i三个选项。
        10. +
      10. 对核苷酸/氨基酸序列的分数矩阵和gap处理等参数。
        11. +
      +

      3.3. 结果

      提交之后，在网页中可以看到比对结果，并可以下载fasta/clustal格式的比对结果，也可以转化成phylip/nexus/msf/gcg等格式。

      +

      还可以点击Refine dataset进入编辑界面，对比对结果进行进一步的编辑，比如对指定序列进行反向互补操作，保留或删除指定序列。

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      4. MAFFT命令行版的–add用法

      命令行版也可以使用–add功能，具体参数参考：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/addsequences.html

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      5. MAFFT的merge功能

      MAFFT还有一个merge模块，网页版：https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/merge.html

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      merge模块用于合并两个或更多已比对好的sub MSAs。当假定这些sub MSAs在系统发育关系上是各自独立为一单系时，即系统树上各自不重叠时，可使用merge模块。如果系统发育关系不独立，则推荐使用–add模块。

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      6. references

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      1. https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/
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      • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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      • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
        • +
      +]]>       + + bioinfo + alignment + align + + + alignment + Multiple Sequence Alignment + MSA + sequence alignment + MAFFT + add + merge + +       用Gblocks对序列比对进行过滤 /2023/09/30/bioinfo_alignment_trim_Gblocks/ @@ -3186,25 +3186,142 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 - GFF3文件处理软件 —— GFF3toolkit工具包的介绍和使用 - /2022/05/24/bioinfo_fileformat_GFF3toolkit/ - - -

      1. GFF3toolkit 简介

      GFF3toolkit是用于处理GFF3格式文件的一个基于python的工具包，功能包括检测GFF3格式错误，修正GFF3格式错误，合并GFF3格式文件，排序GFF3格式文件，用GFF3格式文件生成序列等。

      -

      2. GFF3toolkit 安装

      pip install gff3tool

      -

      3. GFF3toolkit 模块

      GFF3toolkit包含许多模块：

      -
        -
      • gff3_QC：检测gff3格式错误
        • -
      • gff3_fix：修正gff3格式错误
        • -
      • gff3_merge：合并两个gff3文件
        • -
      • gff3_sort：根据scaffold，coordinates坐标来排序gff3文件
        • -
      • gff3_to_fasta：根据基因组fasta和注释gff生成gene/cds/protein/exon等序列
        • -
      -

      4. GFF3toolkit 使用

      4.1. gff3_merge

      用于合并两个gff3注释文件。

      + 从codon比对的cds序列中提取四倍简并位点 + /2021/10/10/bioinfo_extract.4dtv.from.cds/ + 1. 从condon比对的cds序列中提取四倍简并位点

      输入文件是根据密码子规则（即三个三个对齐）比对好的cds序列，输出文件是以其中一个物种的4dtv为标准提取所有物种的4dtv位点，提取的也是按照比对前的顺序排列，结果保存在4dtv.aln文件中。

      +

      1.1. 输入数据和变量定义

        +
      1. cds=/path/to/cds.aln # 定义变量cds为codon模式比对好的cds序列
        2. +
      2. species=Athaliana #以哪个物种的4dtv为标准提取，就定义变量species为那个物种的序列ID
        3. +
      +

      1.2. 三种方案【选择一种】

      1.2.1. 一步生成

        +
      1. 一步生成运行文件，生成从cds获取4dtv的命令，很长，所以储存在文件4dtv.sh中。运行4dtv.sh就可以获取
        seqkit locate -V 0 -i -d -p GCN -p CGN -p GGN -p CTN -p CCN -p TCN -p ACN -p GTN ${cds} |awk -v awka="${species}" '{if ($1 == awka && $6%3== 0) print $6}'|sort -k 1n |uniq |awk -v awkb="${cds}" '{print "<(seqkit subseq -r "$1":"$1" "awkb")"}' |sed -e '1i\seqkit concat -w 0' -e '$a\> 4dtv.aln'|xargs echo >4dtv.sh
        2. +
      +

      代码含义：用seqkit locate根据4dtv的规则提取位置，然后筛选指定物种的位置，筛选第三位位置是3的整数倍的位置，把第三位位置(即4dtv位点)提取出来，排序去重；再按照seqkit concat要求的格式规则把seqkit concat命令写入提取脚本4dtv.sh中。

      +

      除非位点在1000个以内，否则一步生成运行文件可能会运行失败，推荐用下一种方案。

      +
        +
      1. 运行生成的4dtv.sh，获得4dtv.aln结果
        bash 4dtv.sh
        2. +
      +

      1.2.2. 切割分开运行【推荐】

      如果需要合并的位点超过1000个，一步生成运行文件占用内存，运行较慢，可以分步骤进行。

      +

      如果因为4dtv.sh太长无法运行，可以把4dtv.temp分成1-n几部分（比如1000行作为一个子文件），然后切割各部分分别生成4dtv_n.sh，之后分别运行再合并。

        -

      1. 命令
        gff3_merge -g1 sample1.gff3 -g2 sample2.gff3 -f genome.fa -og merged.gff3 -r merged.report

        +

      2. 生成临时文件4dtv.temp
        seqkit locate -V 0 -i -d -p GCN -p CGN -p GGN -p CTN -p CCN -p TCN -p ACN -p GTN ${cds} |awk -v awka="${species}" '{if ($1 == awka && $6%3== 0) print $6}' |sort -k 1n |uniq >4dtv.temp

        3. -

      3. 参数

        +

      4. 分割临时文件4dtv.temp
        split -l 1000 4dtv.temp -d -a 4 4dtv.temp_
        命令含义：分割文件4dtv.temp成多个文件，每个子文件1000行（-l 1000），以数字（-d）而非字母命名子文件，数字长度为4（-a 4，default是2）；会生成4dtv.temp_0000-nnnn的子文件。

        +
        5. +
      +

      可以先看看4dtv.temp的长度，我尝试了下按1000行切割比较合适，再多就达到能同时打开文件数量上限无法运行了。

      +
        +

      1. 生成4dtv.temp.n.sh
        for i in $(ls 4dtv.temp_*);do cat ${i} |awk -v awkb="${cds}" '{print "<(seqkit subseq -r "$1":"$1" "awkb")"}' |sed -e '1i\seqkit concat -w 0' -e '$a\>'|sed "s/^>$/> ${i}.aln/" |sed 's/$/ \\/g' |sed '$ s/.$//' >${i}.sh; done

        +
        2. +

      2. 运行生成的4dtv.temp.n.sh，获得4dtv.aln_n结果【耗时步骤】
        for i in $(ls 4dtv.temp_*.sh);do bash ${i};done

        +
        3. +
      +

      建议用nohup放到后台运行
      nohup sh -c 'for i in $(ls 4dtv.temp_*.sh);do bash ${i};done' &

      +
        +
      1. 合并子文件，获得最终结果
        seqkit concat ./4dtv.temp_*.aln >4dtv.aln
        2. +
      +

      可以seqkit stats *aln检查是否都是1000长度的序列；以及seqkit stats 4dtv.aln检查是否序列长度与4dtv.temp的行数一致。

      +
        +
      1. 删除中间文件
        rm 4dtv.temp*
        2. +
      +

      1.2.3. 分物种运行【不推荐】

      一开始没发现seqkit concat这个工具，然后自己写的合并，有时会有aln的问题，不建议用。

      +
        +
      1. 定义数组sps为物种列表
        sps=($(seqkit seq -n ${cds}|xargs))
        2. +
      2. 以第六个物种${sps[5]}的4dtv为标准，为每个物种保存一份4dtv.bed文件
        for i in $(echo ${sps[*]}); do cat ${sps[5]}.4dtv|sed "s/${species[5]}/${i}/g" >${i}.4dtv.bed; done
        3. +
      3. 为每个物种提取4dtv位点，保存到4dtv.aln.temp【耗时步骤】
        for i in $(echo ${sps[*]}); do seqkit subseq --bed ${i}.4dtv.bed ${cds} | grep -v ">"|xargs echo |sed "1i\>${i}" >${i}.4dtv.aln.temp; done
        4. +
      4. 合并物种的4dtv位点
        cat *.4dtv.aln.temp >4dtv.aln #合并
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      1. 为fasta/fastq格式文件创建索引

        +
      • fasta/fastq文件是用于存储生物序列的常用格式，后缀为fasta/fas/fa/fastq/fq。
        • +
      • 为fasta/fastq创建索引文件，可以快速查找和提取任意位置序列。如使用GATK,IGV等软件时用到。
        • +
      • samtools faidx sample.fa命令即可创建sample.fa.fai索引文件。
        • +
      • samtools faidx命令对fasta文件的格式有要求。即对每条序列内，除最后一行外，其他行长度必须相同，行末尾的换行符也必须一致（Unix-style或Windows-style）。同一个fasta文件内的不同序列间的长度和换行符可以不一致，但同一条序列内部必须一致。
        • +
      • samtools faidx命令对fastq文件的格式的要求是fastq的碱基质量行必须与序列行有着一样的长度。
        • +
      +

      2. 索引文件含义

      .fai文件是文本文件，列间用TAB(\t)分隔，fa.fai共五列，fq.fai共六列（多一列QUALOFFSET）。

      +

      2.1. fai文件的六列

      NAME	Name of this reference sequence
      LENGTH	Total length of this reference sequence, in bases
      OFFSET	Offset in the FASTA/FASTQ file of this sequence's first base
      LINEBASES	The number of bases on each line
      LINEWIDTH	The number of bytes in each line, including the newline
      QUALOFFSET	Offset of sequence's first quality within the FASTQ file
      + +

      2.2. 每列的含义

        +
      1. NAME：序列名称，保留>符号后到第一个空格前的字符串。与SAM文件的@SO header的SN值一致。
        2. +
      2. LENGTH：序列长度，即碱基的数量。与SAM文件的@SO header的SL值一致。
        3. +
      3. OFFSET：OFFSET（偏移）列包含该序列第一个碱基在 FASTA/FASTQ 文件中的偏移量（以字节为单位，从零开始计数，换行符也统计在内），即从标题行（FASTA 中为”>”行，FASTQ 中为”@”行）的第一个字符到此条序列的第一个碱基（包括换行符）的字符数量。通常情况下，fai 索引文件的各行是按照序列在 FASTA/FASTQ 文件中出现的顺序排列的，因此 .fai 文件通常是按照这一列排序的。
        4. +
      4. LINEBASES：除了较短的最后一行外， 其他代表序列的行的碱基数， 单位为bp；
        5. +
      5. LINEWIDTH：除了较短的最后一行外， 其他代表序列的行的长度。与LINEBASES不同的是，LINEWIDTH 包括换行符， unix系统中换行符为\n，在序列长度基础上加1；Windows系统中换行符为\r\n, 要在序列长度的基础上加2。
        6. +
      6. QUALOFFSET：与 OFFSET 相同，但针对的是序列的第一个质量分数。这将是 “+”行末尾换行后的第一个字符。仅适用于 FASTQ 文件。
        7. +
      +

      2.3. 例子

      https://www.htslib.org/doc/faidx.html 中有一些fasta和fastq文件的索引文件的例子。

      +

      3. 应用

        +
      1. 提取指定位置序列：samtools faidx sample.fa chr1 >chr1.fa;samtools faidx sample.fa chr1:100-235 >chr1_partial.fa。
        2. +
      2. 统计fasta序列长度，保存到bed格式文件：samtools faidx sample.fa && awk '{print $1"\t1\t"$2}' sample.fa.fai > sample.fa.bed
        3. +
      +

      4. references

        +
      1. https://www.htslib.org/doc/faidx.html
        2. +
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      • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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      • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
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      + + + +]]>       + + bioinfo + fileformat + fasta + + + samtools + faidx + fasta + fas + fa + fastq + fq + fai + +       + + GFF3文件处理软件 —— GFF3toolkit工具包的介绍和使用 + /2022/05/24/bioinfo_fileformat_GFF3toolkit/ + + +

      1. GFF3toolkit 简介

      GFF3toolkit是用于处理GFF3格式文件的一个基于python的工具包，功能包括检测GFF3格式错误，修正GFF3格式错误，合并GFF3格式文件，排序GFF3格式文件，用GFF3格式文件生成序列等。

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      2. GFF3toolkit 安装

      pip install gff3tool

      +

      3. GFF3toolkit 模块

      GFF3toolkit包含许多模块：

      +
        +
      • gff3_QC：检测gff3格式错误
        • +
      • gff3_fix：修正gff3格式错误
        • +
      • gff3_merge：合并两个gff3文件
        • +
      • gff3_sort：根据scaffold，coordinates坐标来排序gff3文件
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      • gff3_to_fasta：根据基因组fasta和注释gff生成gene/cds/protein/exon等序列
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      4. GFF3toolkit 使用

      4.1. gff3_merge

      用于合并两个gff3注释文件。

      +
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      1. 命令
        gff3_merge -g1 sample1.gff3 -g2 sample2.gff3 -f genome.fa -og merged.gff3 -r merged.report

        +
        2. +

      2. 参数

        @@ -3346,120 +3463,151 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 - 从codon比对的cds序列中提取四倍简并位点 - /2021/10/10/bioinfo_extract.4dtv.from.cds/ - 1. 从condon比对的cds序列中提取四倍简并位点

      输入文件是根据密码子规则（即三个三个对齐）比对好的cds序列，输出文件是以其中一个物种的4dtv为标准提取所有物种的4dtv位点，提取的也是按照比对前的顺序排列，结果保存在4dtv.aln文件中。

      -

      1.1. 输入数据和变量定义

        -
      1. cds=/path/to/cds.aln # 定义变量cds为codon模式比对好的cds序列
        2. -
      2. species=Athaliana #以哪个物种的4dtv为标准提取，就定义变量species为那个物种的序列ID
        3. + 转换GenBank文件为tbl格式，为提交注释做准备 + /2022/06/16/bioinfo_fileformat_gb2tbl/ + + +

        1. 简介

          +
        • GenBank格式常常出现在细胞器基因组的注释软件的结果中，但上传细胞器注释到公共数据库（eg NCBI）需要tbl格式文件。
          • +
        • 这篇文章介绍了几种把GenBank格式文件转换成tbl格式的方法。包括在线工具GB2sequin（此工具还包含验证和运行tbl2asn功能，可用于准备上传NCBI的注释文件），以及两个python2写的转换脚本。
          • +
        +

        1.1. GenBank格式

        GenBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，数据库中用gb格式文件（后缀.gb，.gbk）记录基因注释信息。

        +

        GenBank文件格式标准参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html

        +

        1.2. tbl格式(for Sequin)

        用于提交基因注释到GenBank的一种tab分隔的五栏的特征表（feature table）文件格式（后缀.tbl）。

        +

        tbl文件格式标准参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/feature_table/

        +

        2. GB2sequin在线工具【推荐】

        2.1. 简介

        GB2sequin是用于转换GenBank格式文件为NCBI提交格式Sequin（包括tbl文件和sqn文件）的在线工具，包含验证GenBank注释的功能和运行tbl2asn的功能。

        +

        网址是：

        +

        https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html

        +

        2.2. 优势

          +
        1. 通过网页在线转换，方便快捷。
          2. +
        2. 自动对注释进行验证，并生成错误报告，可根据错误报告修正注释。
          3. +
        3. 支持在输入中加入作者信息的template等文件。
          4. +
        4. 自动运行tbl2asn，生成sqn文件，方便提交tbl文件到NCBI。
          5. +
        5. 自动生成标准的GenBank格式文件，去除冗余。
        -

        1.2. 三种方案【选择一种】

        1.2.1. 一步生成

          -
        1. 一步生成运行文件，生成从cds获取4dtv的命令，很长，所以储存在文件4dtv.sh中。运行4dtv.sh就可以获取
          seqkit locate -V 0 -i -d -p GCN -p CGN -p GGN -p CTN -p CCN -p TCN -p ACN -p GTN ${cds} |awk -v awka="${species}" '{if ($1 == awka && $6%3== 0) print $6}'|sort -k 1n |uniq |awk -v awkb="${cds}" '{print "<(seqkit subseq -r "$1":"$1" "awkb")"}' |sed -e '1i\seqkit concat -w 0' -e '$a\> 4dtv.aln'|xargs echo >4dtv.sh
          2. +

          2.3. 使用步骤

            +
          1. 上传GenBank格式文件，要在文件末包含注释的序列，否则运行结果空白。
            2. +
          2. 【推荐】上传Author Submission Template。可以在https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/template/submission/上填写信息后导出template.sbt文件用于上传。
            3. +
          3. 【可选】上传Source Modifier Table，Gene Product Specification Table。
            4. +
          4. 选择分子类别”Molecule Type”，一般默认genomic DNA即可。
            5. +
          5. 选择是否是完整(complete)，环状(circular)的基因。
            6. +
          6. 选择编码方式”Genetic Code”，植物样品选标准Standard。
            7. +
          7. 选择基因位置Location，包括叶绿体chloroplast，线粒体mitochondrion等。
            8. +
          8. 点击Start Conversion，等待几分钟即可得到结果，点击每项结果然后下载（大多是文本文件）。
            9. +
          9. 根据验证结果文件的错误ERROR和警告WARNING逐一修改原始GenBank文件。
            10. +
          10. 再次运行，重复以上操作，直至无错误和警告，即可使用sqn文件上传至NCBI。
          -

          代码含义：用seqkit locate根据4dtv的规则提取位置，然后筛选指定物种的位置，筛选第三位位置是3的整数倍的位置，把第三位位置(即4dtv位点)提取出来，排序去重；再按照seqkit concat要求的格式规则把seqkit concat命令写入提取脚本4dtv.sh中。

          -

          除非位点在1000个以内，否则一步生成运行文件可能会运行失败，推荐用下一种方案。

          +

          验证结果的含义（tbl2asn运行的部分）可以参考之前写的基因组提交的博客：https://yanzhongsino.github.io/2022/03/22/omics_genome.submit/

          +

          2.4. 结果

          结果文件包括：

          +
            +
          1. FASTA：从GenBank提取的fasta文件。
            2. +
          2. Annotation Table：tbl文件。
            3. +
          3. tbl2asn log：tbl2asn运行的log文件。
            4. +
          4. Sequin：sqn文件，用于提交给NCBI。
            5. +
          5. GenBank：标准化的GenBank文件。
            6. +
          6. Validation：验证结果文件，包括细节。
            7. +
          7. Validation Summary：验证结果的概括。
            8. +
          +

          3. genbank2tbl的脚本

            +
          • 只要GB2sequin可以用，就强烈推荐GB2sequin，毕竟自带验证功能和自动运行tbl2asn。
            • +
          • 如果GB2sequin不可用（比如要用的时候服务器宕机了之类的原因，我才不会告诉你我就是这么走运才探索了一下脚本），可用脚本进行GenBank到tbl的格式转换。
            • +
          • 由于都是陈年老脚本，以下脚本都是用python2写的，并且调用了biopython（提前安装biopython）。
            • +
          +

          脚本gbf2tbl.pl【NCBI 官方出品】

            +
          1. 简介
            2. +
          +
            +
          • 脚本gbf2tbl.pl是NCBI官方提供的perl脚本。
            • +
          • 我暂时还没用过，先记在这。
            • +
            -
          1. 运行生成的4dtv.sh，获得4dtv.aln结果
            bash 4dtv.sh
            2. +
          2. 下载
            wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov//toolbox/ncbi_tools/converters/scripts/gbf2tbl.pl
          -

          1.2.2. 切割分开运行【推荐】

          如果需要合并的位点超过1000个，一步生成运行文件占用内存，运行较慢，可以分步骤进行。

          -

          如果因为4dtv.sh太长无法运行，可以把4dtv.temp分成1-n几部分（比如1000行作为一个子文件），然后切割各部分分别生成4dtv_n.sh，之后分别运行再合并。

          -
            -

          1. 生成临时文件4dtv.temp
            seqkit locate -V 0 -i -d -p GCN -p CGN -p GGN -p CTN -p CCN -p TCN -p ACN -p GTN ${cds} |awk -v awka="${species}" '{if ($1 == awka && $6%3== 0) print $6}' |sort -k 1n |uniq >4dtv.temp

            +

            3.1. 脚本genbank_to_tbl.py【推荐】

            3.1.1. 简介

            genbank_to_tbl.py脚本用于转换genbank格式的gene，CDS，exon，intron，tRNA，rRNA，pseudo genes等注释为tbl格式。

            +

            3.1.2. 脚本

            下载地址：https://gist.github.com/nickloman/2660685

            +
            # requires biopython
            # run like:
            #   genbank_to_tbl.py "my organism name" "my strain ID" "ncbi project id" < my_sequence.gbk
            #   writes seq.fsa, seq.tbl as output

            import sys
            from copy import copy
            from Bio import SeqIO

            def find_gene_entry(features, locus_tag):
                for f in features:
                    if f.type == 'gene':
                        if f.qualifiers['locus_tag'][0] == locus_tag:
                            return f
                print locus_tag
                raise ValueError

            coding = ['CDS', 'tRNA', 'rRNA']

            def go():
                seqid = 0
                fasta_fh = open("seq.fsa", "w")
                feature_fh = open("seq.tbl", "w")
                allowed_tags = ['locus_tag', 'gene', 'product', 'pseudo', 'protein_id', 'gene_desc', 'old_locus_tag']
                records = list(SeqIO.parse(sys.stdin, "genbank"))

                for rec in records:
                    for f in rec.features:
                        if f.type in coding and 'gene' in f.qualifiers:
                            print f.qualifiers['locus_tag'][0]

                            f2 = find_gene_entry(rec.features, f.qualifiers['locus_tag'][0])
                            f2.qualifiers['gene'] = f.qualifiers['gene']

                            del f.qualifiers['gene']

                for rec in records:
                    seqid += 1

                    if len(rec) <= 200:
                        print >>sys.stderr, "skipping small contig %s" % (rec.id,)
                        continue

            #        rec.id = rec.name = "%s%08d" % (sys.argv[4], seqid,)

                    circular = rec.annotations.get('molecule', 'linear')
                    rec.description = "[organism=%s] [strain=%s] [topology=%s] [molecule=DNA] [tech=wgs] [gcode=11]" % (sys.argv[1], sys.argv[2], circular)
                    SeqIO.write([rec], fasta_fh, "fasta")

                    print >>feature_fh, ">Feature %s" % (rec.name,)
                    for f in rec.features:
                        if f.strand == 1:
                            print >>feature_fh, "%d\t%d\t%s" % (f.location.nofuzzy_start + 1, f.location.nofuzzy_end, f.type)
                        else:
                            print >>feature_fh, "%d\t%d\t%s" % (f.location.nofuzzy_end, f.location.nofuzzy_start + 1, f.type)

                        if f.type == 'CDS' and 'product' not in f.qualifiers:
                            f.qualifiers['product'] = ['hypothetical protein']

                        if f.type == 'CDS':
                            f.qualifiers['protein_id'] = ["gnl|ProjectID_%s|%s" % (sys.argv[3], f.qualifiers['locus_tag'][0])]

                        if f.type in coding:
                            del f.qualifiers['locus_tag']

                        for key, vals in f.qualifiers.iteritems():
                            my_allowed_tags = copy(allowed_tags)
                            if 'pseudo' in f.qualifiers:
                                my_allowed_tags.append('note')

                            if key not in my_allowed_tags:
                                continue

                            for v in vals:
                                if len(v) or key == 'pseudo':
                                    print >>feature_fh, "\t\t\t%s\t%s" % (key, v)


            go()
            + +

            3.1.3. 使用

              +

            1. 命令
              python2 genbank_to_tbl.py sample mc_01 ncbi_id < sample.gb

              2. -

            2. 分割临时文件4dtv.temp
              split -l 1000 4dtv.temp -d -a 4 4dtv.temp_
              命令含义：分割文件4dtv.temp成多个文件，每个子文件1000行（-l 1000），以数字（-d）而非字母命名子文件，数字长度为4（-a 4，default是2）；会生成4dtv.temp_0000-nnnn的子文件。

              +

            3. 参数

            -

            可以先看看4dtv.temp的长度，我尝试了下按1000行切割比较合适，再多就达到能同时打开文件数量上限无法运行了。

            +
              +
            • sample：样品名称，organism name
              • +
            • mc_01：品种编号，strain ID
              • +
            • ncbi_id：NCBI项目ID
              • +
            • < sample.gb：输入genbank格式文件
              • +
            +

            四个参数都是必需参数。

              -

            1. 生成4dtv.temp.n.sh
              for i in $(ls 4dtv.temp_*);do cat ${i} |awk -v awkb="${cds}" '{print "<(seqkit subseq -r "$1":"$1" "awkb")"}' |sed -e '1i\seqkit concat -w 0' -e '$a\>'|sed "s/^>$/> ${i}.aln/" |sed 's/$/ \\/g' |sed '$ s/.$//' >${i}.sh; done

              -
              2. -

            2. 运行生成的4dtv.temp.n.sh，获得4dtv.aln_n结果【耗时步骤】
              for i in $(ls 4dtv.temp_*.sh);do bash ${i};done

              -
              3. +
            3. 输出
            -

            建议用nohup放到后台运行
            nohup sh -c 'for i in $(ls 4dtv.temp_*.sh);do bash ${i};done' &

            -
              -
            1. 合并子文件，获得最终结果
              seqkit concat ./4dtv.temp_*.aln >4dtv.aln
              2. +
                +
              • seq.fsa：基因组序列
                • +
              • seq.tbl：tbl格式文件
                • +
              +
                +
              1. notes
              -

              可以seqkit stats *aln检查是否都是1000长度的序列；以及seqkit stats 4dtv.aln检查是否序列长度与4dtv.temp的行数一致。

              -
                -
              1. 删除中间文件
                rm 4dtv.temp*
                2. +
                  +
                • seq.tbl结果中包含genbank注释的gene，CDS，exon，intron，tRNA，rRNA，pseudo genes等结果。
                  • +
                • 需要在输入的genbank文件中包含locus_tag的值（可以用基因名称），否则报错。
                  • +
                +

                3.2. Genbank2Sequin.py

                3.2.1. 简介

                Genbank2Sequin.py脚本用于批量转换genbank格式的gene和CDS注释为tbl格式。

                +

                3.2.2. 脚本

                下载地址：https://github.com/Van-Doorslaer/Genbank2sequin/blob/master/Genbank2Sequin.py

                +
                from Bio import SeqIO
                import re, glob, os

                for f in glob.glob("*.gb"):
                    ID = f.split(".")[0]
                    for r in SeqIO.parse(f,"genbank"):
                        #print r.features
                        with open(ID+'.fsa', 'w') as fasta, open(ID+".tbl", 'w') as table:
                            print >> fasta, ">%s [organism=Human papillomavirus %s]\n%s" %(ID, ID, r.seq)
                            print >>table, ">Feature "+ID 
                            for (index, feature) in enumerate(r.features):
                                if feature.type ==  'CDS':
                                    m=re.search('\[(\d*)\:(\d*)\]',str(feature.location))
                                    if m:
                                        #print feature.qualifiers
                                        print >>table, "%s\t%s\tgene\n\t\t\tgene\t%s" %(int(m.groups()[0])+1, m.groups()[1],feature.qualifiers['note'][0])
                                        print >>table, "%s\t%s\tCDS\n\t\t\tproduct\t%s\n\t\t\tgene\t%s\n\t\t\tcodon_start\t1" %(int(m.groups()[0])+1, m.groups()[1], feature.qualifiers['note'][0], feature.qualifiers['note'][0])
                + +

                3.2.3. 使用

                  +
                1. 命令
                  python2 Genbank2Sequin.py
                -

                1.2.3. 分物种运行【不推荐】

                一开始没发现seqkit concat这个工具，然后自己写的合并，有时会有aln的问题，不建议用。

                -
                  -
                1. 定义数组sps为物种列表
                  sps=($(seqkit seq -n ${cds}|xargs))
                  2. -
                2. 以第六个物种${sps[5]}的4dtv为标准，为每个物种保存一份4dtv.bed文件
                  for i in $(echo ${sps[*]}); do cat ${sps[5]}.4dtv|sed "s/${species[5]}/${i}/g" >${i}.4dtv.bed; done
                  3. -
                3. 为每个物种提取4dtv位点，保存到4dtv.aln.temp【耗时步骤】
                  for i in $(echo ${sps[*]}); do seqkit subseq --bed ${i}.4dtv.bed ${cds} | grep -v ">"|xargs echo |sed "1i\>${i}" >${i}.4dtv.aln.temp; done
                  4. -
                4. 合并物种的4dtv位点
                  cat *.4dtv.aln.temp >4dtv.aln #合并
                  5. +
                    +
                  • 运行后会自动搜索当前文件夹下的所有.gb后缀文件，然后把gene和CDS的注释转换为.tbl文件。
                    • +
                  +
                    +
                  1. 输出
                  -
                    -
                  • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                    • -
                  • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                    • +
                  • *.tbl：tbl格式文件。
                  -]]> - - bioinfo - 4dtv - - - 4dtv - codon - - - - samtools faidx创建fasta/fastq格式文件的.fai格式索引文件 - /2023/11/24/bioinfo_fileformat_fa_fai/ - - -

                  1. 为fasta/fastq格式文件创建索引

                    -
                  • fasta/fastq文件是用于存储生物序列的常用格式，后缀为fasta/fas/fa/fastq/fq。
                    • -
                  • 为fasta/fastq创建索引文件，可以快速查找和提取任意位置序列。如使用GATK,IGV等软件时用到。
                    • -
                  • samtools faidx sample.fa命令即可创建sample.fa.fai索引文件。
                    • -
                  • samtools faidx命令对fasta文件的格式有要求。即对每条序列内，除最后一行外，其他行长度必须相同，行末尾的换行符也必须一致（Unix-style或Windows-style）。同一个fasta文件内的不同序列间的长度和换行符可以不一致，但同一条序列内部必须一致。
                    • -
                  • samtools faidx命令对fastq文件的格式的要求是fastq的碱基质量行必须与序列行有着一样的长度。
                    • -
                  -

                  2. 索引文件含义

                  .fai文件是文本文件，列间用TAB(\t)分隔，fa.fai共五列，fq.fai共六列（多一列QUALOFFSET）。

                  -

                  2.1. fai文件的六列

                  NAME	Name of this reference sequence
                  LENGTH	Total length of this reference sequence, in bases
                  OFFSET	Offset in the FASTA/FASTQ file of this sequence's first base
                  LINEBASES	The number of bases on each line
                  LINEWIDTH	The number of bytes in each line, including the newline
                  QUALOFFSET	Offset of sequence's first quality within the FASTQ file
                  - -

                  2.2. 每列的含义

                    -
                  1. NAME：序列名称，保留>符号后到第一个空格前的字符串。与SAM文件的@SO header的SN值一致。
                    2. -
                  2. LENGTH：序列长度，即碱基的数量。与SAM文件的@SO header的SL值一致。
                    3. -
                  3. OFFSET：OFFSET（偏移）列包含该序列第一个碱基在 FASTA/FASTQ 文件中的偏移量（以字节为单位，从零开始计数，换行符也统计在内），即从标题行（FASTA 中为”>”行，FASTQ 中为”@”行）的第一个字符到此条序列的第一个碱基（包括换行符）的字符数量。通常情况下，fai 索引文件的各行是按照序列在 FASTA/FASTQ 文件中出现的顺序排列的，因此 .fai 文件通常是按照这一列排序的。
                    4. -
                  4. LINEBASES：除了较短的最后一行外， 其他代表序列的行的碱基数， 单位为bp；
                    5. -
                  5. LINEWIDTH：除了较短的最后一行外， 其他代表序列的行的长度。与LINEBASES不同的是，LINEWIDTH 包括换行符， unix系统中换行符为\n，在序列长度基础上加1；Windows系统中换行符为\r\n, 要在序列长度的基础上加2。
                    6. -
                  6. QUALOFFSET：与 OFFSET 相同，但针对的是序列的第一个质量分数。这将是 “+”行末尾换行后的第一个字符。仅适用于 FASTQ 文件。
                    7. -
                  -

                  2.3. 例子

                  https://www.htslib.org/doc/faidx.html 中有一些fasta和fastq文件的索引文件的例子。

                  -

                  3. 应用

                    -
                  1. 提取指定位置序列：samtools faidx sample.fa chr1 >chr1.fa;samtools faidx sample.fa chr1:100-235 >chr1_partial.fa。
                    2. -
                  2. 统计fasta序列长度，保存到bed格式文件：samtools faidx sample.fa && awk '{print $1"\t1\t"$2}' sample.fa.fai > sample.fa.bed
                    3. +
                      +
                    1. notes
                    -

                    4. references

                      -
                    1. https://www.htslib.org/doc/faidx.html
                      2. +
                        +
                      • *.tbl结果中只包含genbank注释的gene，CDS结果。
                        • +
                      • 需要在输入的genbank文件中包含note的值（可以用基因名称），否则报错。
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                      • 可批量操作多个gb文件。
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                      +

                      4. reference

                        +
                      1. GB2sequin paper：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754318301897?via%3Dihub
                        2. +
                      2. GB2sequin：https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html
                        3. +
                      3. genbank_to_tbl.py：https://gist.github.com/nickloman/2660685
                        4. +
                      4. Genbank2Sequin.py：https://github.com/Van-Doorslaer/Genbank2sequin/blob/master/Genbank2Sequin.py
                        5. +
                      5. genbank格式：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html
                        6. +
                      6. tbl格式：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/feature_table/
                      • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                      • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                      - - - -]]> +]]> bioinfo fileformat - fasta - samtools - faidx - fasta - fas - fa - fastq - fq - fai + GenBank + tbl + organellar genome + genome annotation + genome submit + Sequin + tbl2asn + GB2sequin + gbf2tbl.pl + genbank_to_tbl.py + Genbank2Sequin.py @@ -3535,159 +3683,11 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 mitogenome organelle + tbl mitogenomics aln2tbl.py aln2tbl-legacy.py mitos2fasta.py - tbl - - - - 转换GenBank文件为tbl格式，为提交注释做准备 - /2022/06/16/bioinfo_fileformat_gb2tbl/ - - -

                      1. 简介

                        -
                      • GenBank格式常常出现在细胞器基因组的注释软件的结果中，但上传细胞器注释到公共数据库（eg NCBI）需要tbl格式文件。
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                      • 这篇文章介绍了几种把GenBank格式文件转换成tbl格式的方法。包括在线工具GB2sequin（此工具还包含验证和运行tbl2asn功能，可用于准备上传NCBI的注释文件），以及两个python2写的转换脚本。
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                      1.1. GenBank格式

                      GenBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，数据库中用gb格式文件（后缀.gb，.gbk）记录基因注释信息。

                      -

                      GenBank文件格式标准参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html

                      -

                      1.2. tbl格式(for Sequin)

                      用于提交基因注释到GenBank的一种tab分隔的五栏的特征表（feature table）文件格式（后缀.tbl）。

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                      tbl文件格式标准参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/feature_table/

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                      2. GB2sequin在线工具【推荐】

                      2.1. 简介

                      GB2sequin是用于转换GenBank格式文件为NCBI提交格式Sequin（包括tbl文件和sqn文件）的在线工具，包含验证GenBank注释的功能和运行tbl2asn的功能。

                      -

                      网址是：

                      -

                      https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html

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                      2.2. 优势

                        -
                      1. 通过网页在线转换，方便快捷。
                        2. -
                      2. 自动对注释进行验证，并生成错误报告，可根据错误报告修正注释。
                        3. -
                      3. 支持在输入中加入作者信息的template等文件。
                        4. -
                      4. 自动运行tbl2asn，生成sqn文件，方便提交tbl文件到NCBI。
                        5. -
                      5. 自动生成标准的GenBank格式文件，去除冗余。
                        6. -
                      -

                      2.3. 使用步骤

                        -
                      1. 上传GenBank格式文件，要在文件末包含注释的序列，否则运行结果空白。
                        2. -
                      2. 【推荐】上传Author Submission Template。可以在https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/template/submission/上填写信息后导出template.sbt文件用于上传。
                        3. -
                      3. 【可选】上传Source Modifier Table，Gene Product Specification Table。
                        4. -
                      4. 选择分子类别”Molecule Type”，一般默认genomic DNA即可。
                        5. -
                      5. 选择是否是完整(complete)，环状(circular)的基因。
                        6. -
                      6. 选择编码方式”Genetic Code”，植物样品选标准Standard。
                        7. -
                      7. 选择基因位置Location，包括叶绿体chloroplast，线粒体mitochondrion等。
                        8. -
                      8. 点击Start Conversion，等待几分钟即可得到结果，点击每项结果然后下载（大多是文本文件）。
                        9. -
                      9. 根据验证结果文件的错误ERROR和警告WARNING逐一修改原始GenBank文件。
                        10. -
                      10. 再次运行，重复以上操作，直至无错误和警告，即可使用sqn文件上传至NCBI。
                        11. -
                      -

                      验证结果的含义（tbl2asn运行的部分）可以参考之前写的基因组提交的博客：https://yanzhongsino.github.io/2022/03/22/omics_genome.submit/

                      -

                      2.4. 结果

                      结果文件包括：

                      -
                        -
                      1. FASTA：从GenBank提取的fasta文件。
                        2. -
                      2. Annotation Table：tbl文件。
                        3. -
                      3. tbl2asn log：tbl2asn运行的log文件。
                        4. -
                      4. Sequin：sqn文件，用于提交给NCBI。
                        5. -
                      5. GenBank：标准化的GenBank文件。
                        6. -
                      6. Validation：验证结果文件，包括细节。
                        7. -
                      7. Validation Summary：验证结果的概括。
                        8. -
                      -

                      3. genbank2tbl的脚本

                        -
                      • 只要GB2sequin可以用，就强烈推荐GB2sequin，毕竟自带验证功能和自动运行tbl2asn。
                        • -
                      • 如果GB2sequin不可用（比如要用的时候服务器宕机了之类的原因，我才不会告诉你我就是这么走运才探索了一下脚本），可用脚本进行GenBank到tbl的格式转换。
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                      • 由于都是陈年老脚本，以下脚本都是用python2写的，并且调用了biopython（提前安装biopython）。
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                      脚本gbf2tbl.pl【NCBI 官方出品】

                        -
                      1. 简介
                        2. -
                      -
                        -
                      • 脚本gbf2tbl.pl是NCBI官方提供的perl脚本。
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                      • 我暂时还没用过，先记在这。
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                        -
                      1. 下载
                        wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov//toolbox/ncbi_tools/converters/scripts/gbf2tbl.pl
                        2. -
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                      3.1. 脚本genbank_to_tbl.py【推荐】

                      3.1.1. 简介

                      genbank_to_tbl.py脚本用于转换genbank格式的gene，CDS，exon，intron，tRNA，rRNA，pseudo genes等注释为tbl格式。

                      -

                      3.1.2. 脚本

                      下载地址：https://gist.github.com/nickloman/2660685

                      -
                      # requires biopython
                      # run like:
                      #   genbank_to_tbl.py "my organism name" "my strain ID" "ncbi project id" < my_sequence.gbk
                      #   writes seq.fsa, seq.tbl as output

                      import sys
                      from copy import copy
                      from Bio import SeqIO

                      def find_gene_entry(features, locus_tag):
                          for f in features:
                              if f.type == 'gene':
                                  if f.qualifiers['locus_tag'][0] == locus_tag:
                                      return f
                          print locus_tag
                          raise ValueError

                      coding = ['CDS', 'tRNA', 'rRNA']

                      def go():
                          seqid = 0
                          fasta_fh = open("seq.fsa", "w")
                          feature_fh = open("seq.tbl", "w")
                          allowed_tags = ['locus_tag', 'gene', 'product', 'pseudo', 'protein_id', 'gene_desc', 'old_locus_tag']
                          records = list(SeqIO.parse(sys.stdin, "genbank"))

                          for rec in records:
                              for f in rec.features:
                                  if f.type in coding and 'gene' in f.qualifiers:
                                      print f.qualifiers['locus_tag'][0]

                                      f2 = find_gene_entry(rec.features, f.qualifiers['locus_tag'][0])
                                      f2.qualifiers['gene'] = f.qualifiers['gene']

                                      del f.qualifiers['gene']

                          for rec in records:
                              seqid += 1

                              if len(rec) <= 200:
                                  print >>sys.stderr, "skipping small contig %s" % (rec.id,)
                                  continue

                      #        rec.id = rec.name = "%s%08d" % (sys.argv[4], seqid,)

                              circular = rec.annotations.get('molecule', 'linear')
                              rec.description = "[organism=%s] [strain=%s] [topology=%s] [molecule=DNA] [tech=wgs] [gcode=11]" % (sys.argv[1], sys.argv[2], circular)
                              SeqIO.write([rec], fasta_fh, "fasta")

                              print >>feature_fh, ">Feature %s" % (rec.name,)
                              for f in rec.features:
                                  if f.strand == 1:
                                      print >>feature_fh, "%d\t%d\t%s" % (f.location.nofuzzy_start + 1, f.location.nofuzzy_end, f.type)
                                  else:
                                      print >>feature_fh, "%d\t%d\t%s" % (f.location.nofuzzy_end, f.location.nofuzzy_start + 1, f.type)

                                  if f.type == 'CDS' and 'product' not in f.qualifiers:
                                      f.qualifiers['product'] = ['hypothetical protein']

                                  if f.type == 'CDS':
                                      f.qualifiers['protein_id'] = ["gnl|ProjectID_%s|%s" % (sys.argv[3], f.qualifiers['locus_tag'][0])]

                                  if f.type in coding:
                                      del f.qualifiers['locus_tag']

                                  for key, vals in f.qualifiers.iteritems():
                                      my_allowed_tags = copy(allowed_tags)
                                      if 'pseudo' in f.qualifiers:
                                          my_allowed_tags.append('note')

                                      if key not in my_allowed_tags:
                                          continue

                                      for v in vals:
                                          if len(v) or key == 'pseudo':
                                              print >>feature_fh, "\t\t\t%s\t%s" % (key, v)


                      go()
                      - -

                      3.1.3. 使用

                        -

                      1. 命令
                        python2 genbank_to_tbl.py sample mc_01 ncbi_id < sample.gb

                        -
                        2. -

                      2. 参数

                        -
                        3. -
                      -
                        -
                      • sample：样品名称，organism name
                        • -
                      • mc_01：品种编号，strain ID
                        • -
                      • ncbi_id：NCBI项目ID
                        • -
                      • < sample.gb：输入genbank格式文件
                        • -
                      -

                      四个参数都是必需参数。

                      -
                        -
                      1. 输出
                        2. -
                      -
                        -
                      • seq.fsa：基因组序列
                        • -
                      • seq.tbl：tbl格式文件
                        • -
                      -
                        -
                      1. notes
                        2. -
                      -
                        -
                      • seq.tbl结果中包含genbank注释的gene，CDS，exon，intron，tRNA，rRNA，pseudo genes等结果。
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                      • 需要在输入的genbank文件中包含locus_tag的值（可以用基因名称），否则报错。
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                      3.2. Genbank2Sequin.py

                      3.2.1. 简介

                      Genbank2Sequin.py脚本用于批量转换genbank格式的gene和CDS注释为tbl格式。

                      -

                      3.2.2. 脚本

                      下载地址：https://github.com/Van-Doorslaer/Genbank2sequin/blob/master/Genbank2Sequin.py

                      -
                      from Bio import SeqIO
                      import re, glob, os

                      for f in glob.glob("*.gb"):
                          ID = f.split(".")[0]
                          for r in SeqIO.parse(f,"genbank"):
                              #print r.features
                              with open(ID+'.fsa', 'w') as fasta, open(ID+".tbl", 'w') as table:
                                  print >> fasta, ">%s [organism=Human papillomavirus %s]\n%s" %(ID, ID, r.seq)
                                  print >>table, ">Feature "+ID 
                                  for (index, feature) in enumerate(r.features):
                                      if feature.type ==  'CDS':
                                          m=re.search('\[(\d*)\:(\d*)\]',str(feature.location))
                                          if m:
                                              #print feature.qualifiers
                                              print >>table, "%s\t%s\tgene\n\t\t\tgene\t%s" %(int(m.groups()[0])+1, m.groups()[1],feature.qualifiers['note'][0])
                                              print >>table, "%s\t%s\tCDS\n\t\t\tproduct\t%s\n\t\t\tgene\t%s\n\t\t\tcodon_start\t1" %(int(m.groups()[0])+1, m.groups()[1], feature.qualifiers['note'][0], feature.qualifiers['note'][0])
                      - -

                      3.2.3. 使用

                        -
                      1. 命令
                        python2 Genbank2Sequin.py
                        2. -
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                        -
                      • 运行后会自动搜索当前文件夹下的所有.gb后缀文件，然后把gene和CDS的注释转换为.tbl文件。
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                        -
                      1. 输出
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                      -
                        -
                      • *.tbl：tbl格式文件。
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                      1. notes
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                      • *.tbl结果中只包含genbank注释的gene，CDS结果。
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                      • 需要在输入的genbank文件中包含note的值（可以用基因名称），否则报错。
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                      • 可批量操作多个gb文件。
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                      4. reference

                        -
                      1. GB2sequin paper：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754318301897?via%3Dihub
                        2. -
                      2. GB2sequin：https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html
                        3. -
                      3. genbank_to_tbl.py：https://gist.github.com/nickloman/2660685
                        4. -
                      4. Genbank2Sequin.py：https://github.com/Van-Doorslaer/Genbank2sequin/blob/master/Genbank2Sequin.py
                        5. -
                      5. genbank格式：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html
                        6. -
                      6. tbl格式：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/feature_table/
                        7. -
                      -
                      -
                        -
                      • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                      • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                        • -
                      -]]>                       - - bioinfo - fileformat - - - tbl - GenBank - organellar genome - genome annotation - genome submit - Sequin - tbl2asn - GB2sequin - gbf2tbl.pl - genbank_to_tbl.py - Genbank2Sequin.py                       @@ -4985,364 +4985,30 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 - 树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）可视化物种树和基因树的RF距离 - /2023/03/13/bioinfo_phylogeny_MDS/ - + 估算系统树分歧时间 —— paml.mcmctree,r8s + /2021/03/25/bioinfo_phylogeny_caculate.divergence.time/ + -

                      1. 树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）可视化物种树和基因树的RF距离

                        -
                      1. 简介
                        2. -
                      +

                      估算分歧时间是在已经建好物种的系统发育树，根据系统发育树上已知类群间分化时间（一般来自化石或者其他研究的标定），或者根据权威研究中对特定类群的碱基替换速率的估计（例如蕨类4.79e-9 subst./syn. site/year，水稻2.5e-8 subst./syn. site/year)进行估算系统发育树上其他类群的分歧时间。

                      +

                      一般来说，我们尽量使用化石证据的时间（更可靠），可以在网站timetree搜索化石或者其他文章标定的类群分化时间；实在没有化石可用时，则使用碱基替换速率常数。

                      +

                      1. 原理

                      尝试用数学思维讲讲估算分歧时间的原理：即路程=速度*时间，经过多长时间（地质时间），通过多大的速度（碱基替换速率），完成从祖先物种的DNA到现在物种的DNA的变化，总体上的碱基替换积累即路程。

                      +

                      假设下面Figure 1. 系统发育树示意图(A4,(A3,(A2,A1)B)C)D;是有枝长有根树，A1-A4都是现在的物种（代表时间也已知），目的是要估算B和C节点的时间。

                      + + +

                      Figure 1. 系统发育示意图

                        -
                      • 当系统发育拓扑冲突时，需要评估基因树与物种树的不一致程度，可使用树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）来对树的RF距离进行降维，并在指定维度可视化基因树与物种树之间的RF距离。
                        • +
                      • 第一种情况，当已知D节点时间时，求B节点时间（C节点同理）
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                        -
                      1. 分析步骤
                        2. -
                      +

                      由于A1的时间点已知（即现在），那么从D到A1的时间跨度是已知的；从D到A1的枝长是已知的，枝长代表的是这个过程的碱基替换数量，即路程；时间和路程已知，我们可以算出速度；同时，从D到B的路程也是已知的（因为枝长已知），那么在假设匀速的前提下，我们也可以算出从D到B的时间，这样即可标定B（即A1和A2分歧时间）的时间。

                        -
                      • 先使用R包ape 5.0计算树之间的成对Robinson-Foulds（RF）距离，然后对RF距离进行多维缩放（multidimensional scaling，MDS），最后绘制指定维度下的RF距离示意图。
                        • +
                      • 第二种情况，当已知速度（碱基替换速率，常数）时，求B节点时间
                      -
                        -
                      1. 结果
                        2. -
                      -
                        -
                      • MDS的二维图如下所示，图中的物种树，包括不同数据和不同软件的物种树（包括ASTRAL_tree，SCGs_ML，SNPs_ML，Plastome_ML树）用其他颜色标示，每个蓝色的点代表一棵基因树，颜色深浅代表支持率平均值的大小。
                        • -
                      - - -

                      图 1. MDS二维图示例

                      -

                      2. 分析过程

                        -
                      1. 输入文件
                        2. -
                      -
                        -
                      • species_genes.tre：物种树和基因树合并的树文件，可以合并多棵物种树（比如用不同算法和数据构建的树）。
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                        -
                      1. 用R包ape计算基因树成对间的Robinson-Foulds（RF）距离
                        2. -
                      -
                      library(ape) # 载入ape包
                      trees<-read.tree("species_genes.tre") # 读取树
                      trees_dist<-dist.topo(trees, method = "PH85") # 计算RF，trees_dist的数据类别是dist
                      trees_matric<-as.matrix(trees_dist) # 转化dist到矩阵matrix
                      write.table (trees_matric, file ="RF_pairs.tsv", sep ="\t") # 保存矩阵数据到RF_pairs.tsv文件
                      - -
                        -
                      • RF_pairs.tsv文件是行和列都是tree1,tree2,…,treen等依次命名的树之间的RF距离矩阵。
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                      1. MDS多维缩放
                        2. -
                      -
                        -
                      • 经典MDS法
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                      -
                      mds <- cmdscale(trees_dist, eig=TRUE, k=2) # k代表维度
                      mds.var.per <- round(mds$eig/sum(mds$eig)*100,1)
                      mds.values <- mds$points
                      mds.data <- data.frame(Sample=rownames(mds.values), X=mds.values[,1], Y=mds.values[,2])
                      write.table(mds.data,file="mds.tsv",sep="\t") # 把MDS的二维值保存到mds.tsv
                      - -
                        -
                      • mds.tsv文件示例。每棵树都有一行数据，这里是二维的，包含MDS1和MDS2两个值。用tree1,tree2,…,treen等依次命名，与species_genes.tre树文件中树的顺序一致。如果合并了物种树和基因树，可以依据顺序在mds.tsv中找到物种树对应的行。
                        • -
                      -
                      "Sample"	"MDS1"	"MDS2"
                      "tree1"	"tree1"	-15.2853071675022	-9.23665453167777
                      "tree2"	"tree2"	-13.8416686613703	-7.78853307096205
                      - -
                        -
                      • nonmetric MDS法
                        • -
                      -
                      library(MASS)
                      mds <- isoMDS(trees_dist, k=2) # k代表维度
                      - -
                        -
                      1. 绘图
                        2. -
                      -
                      library(ggplot2)
                      ggplot(data=mds.data, aes(x=X, y=Y, label=Sample))+
                        geom_text() +
                        xlab(paste("MDS1 - ", mds.var.per[1], "%", sep=""))+
                        ylab(paste("MDS2 - ", mds.var.per[2], "%", sep=""))+
                        theme_bw()+
                        ggtitle("MDS plot using Euclidean distance")
                      - -

                      或者

                      -
                      mds <- cmdscale(trees_dist, eig=TRUE, k=2) # k代表维度
                      x <- mds$points[,1]
                      y <- mds$points[,2]
                      plot(x, y, xlab="Coordinate 1", ylab="Coordinate 2", main="Metric MDS", type="n")
                      text(mds$points, labels = rownames(trees_matric), cex = 0.6)
                      - -

                      结果图保存成pdf后可以在pdf编辑器里把物种树对应的点用更大尺寸和其他颜色标示出来。

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                        -
                      1. 建议
                        2. -
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                        -
                      • 还可以把每个基因树和物种树的支持率的平均值计算出来之后，用支持率给每棵树的MSD点上色，从而查看是否是离物种树越近的基因树的平均支持率越高。
                        • -
                      • 也可以用基因树的平均支持率和基因树离物种树的RF距离画散点图，并做线性回归分析判断相关性。
                        • -
                      -

                      3. references

                        -
                      1. MDS paper：https://academic.oup.com/sysbio/article/67/3/400/4175806
                        2. -
                      -
                      -
                        -
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                      1. Quartet Sampling（QS）method

                      Quartet Sampling（QS）是为系统发育树量化分支的支持率的一种方法，用于区分植物系统发育树上的强烈拓扑冲突和信息不足（缺乏支持）导致的支持率低，即区分强冲突（不一致）和弱支持（不确定性）。

                      -

                      1.1. 原理

                      1.1.1. 四重采样

                        -
                      1. 对于给定的系统发育树，每个内部枝将树划分为四个不重叠的分类群子集（图A）。
                        2. -
                      2. 这四组分类群（也被称为元-四重奏，meta-quartet）可以以三种拓扑关系存在：与给定拓扑一致的关系，以及两种替代的不一致关系（Replicate 1和Replicate 2）。
                        3. -
                      3. QS方法从四个子集中的每一个子集中重复随机采样一个分类单元，然后基于给定序列数据（完全比对或随机采样的基因分区），评估跨越该特定分支的随机选择的四条序列（即四重奏，quartet）的所有三个可能系统发育拓扑的似然值。
                        4. -
                      4. 对于同一分支采样的所有四重奏，评估这四个采样分类群可以采用的所有三种可能拓扑的可能性。
                        5. -
                      5. 然后记录所有重复中具有最佳可能性的四重拓扑并制成表格。
                        6. -
                      6. 此过程生成一组计数（跨每个分支的所有复制），其中一致或两个不一致关系中的每一个都具有最佳可能性。
                        7. -
                      7. 该过程可以通过评估每个四重奏的完全比对的可能性（即在单矩阵框架中）或通过从多基因或全基因组比对（即在多基因树中）的单个基因/分区比对中随机抽样来执行聚结框架）。
                        8. -
                      - - -

                      图1. 四重采样方法的描述
                      图源：https://bsapubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajb2.1016

                      -

                      1.1.2. 评估分数

                      QS 方法使用这些重新采样的四重树计数来计算焦点树的每个内部分支的三个分数(QC,QD,QI）和评估分类单元的QF分数。

                      -

                      总的来说，这四个分数提供了区分信息一致性（Quartet Concordance，QC），次生进化历史的存在（Quartet Differential，QD），信息量（Quartet Informativeness，QI）和树中单个分类群的可靠性（Quartet Fidelity，QF）的方法。

                      -

                      QS方法把这些影响分开，而不是像系统发育支持的标准测量那样将它们混为一个单一的汇总支持率。

                      -
                        -
                      1. Quartet Concordance (QC) score - 四重奏一致性分数
                        2. -
                      -
                        -
                      • QC分数是一种类似熵的度量，量化了四种分类群的三种拓扑之间的相对支持度。
                        • -
                      • 即支持率在三种拓扑中分配越平均，QC值越接近0；越不均，约远离0。
                        • -
                      • 当频率最高的拓扑与输入树一致时，QC 值在 (0,1] 范围内为正。
                        • -
                      • 当所有四重树与输入树的焦点分支一致时，QC 等于 1。
                        • -
                      • 当其中一个不一致的拓扑是最常见的采样四重奏，QC 值在 [-1,0) 范围内为负。
                        • -
                      • 当所有四重奏树都是两个不一致的系统发育拓扑之一时接近 -1。
                        • -
                      • 当三个拓扑中平均分配时，QC 等于 0（或者如果三个可能中只有两个被注册为在所有复制中具有最佳可能性，则在两个之间平均分配）。
                        • -
                      -
                        -
                      1. Quartet Differential (QD) score - 四重奏差异分数
                        2. -
                      -
                        -
                      • QD分数使用基因渐渗的f和D统计量的逻辑（尽管使用四重拓扑比例，而不是位点频率），并测量两个不一致拓扑的采样比例之间的差异。
                        • -
                      • QD 分数没有具体量化基因渗入，也没有识别基因渗入的分类群，但确实表明一种拓扑的频率高于另一种拓扑。
                        • -
                      • QD 的低值表明在两个不一致的拓扑结构之间存在一个倾向性的拓扑结构，这也可能表明在给定分支上有背景谱系分选之外的有偏（biased）生物过程的，包括混杂变量，例如基因渗入、强烈的异质性、异质碱基组成等。
                        • -
                      • QD 表示支持率在两种替代拓扑上的差异水平，在 [0,1] 范围内变化，值为 1 表示两棵替代拓扑树的比例没有偏斜（skew），值为0 表示采样的所有不一致树仅来自两种替代关系之一。
                        • -
                      -
                        -
                      1. Quartet Informativeness (QI) score - 四重奏信息分数
                        2. -
                      -
                        -
                      • 在给定最佳和次佳的差异阈值的基础上，最佳似然四重树的似然值超过了次优似然值的四重树。这种情况下，QI分数量化了给定分支的复制比例。
                        • -
                      • 该分数表明，当分子数据在拓扑上有效地模棱两可时（即，当三个可能的四重拓扑中的两个或所有三个具有几乎无法区分的似然分数时），重复不被视为一致或不一致。
                        • -
                      • QI在 [0,1] 范围内变化，表示超过阈值的采样四重奏的比例。
                        • -
                      • QI 值为 1 表示所有四重奏都提供信息，而值为 0 表示所有四重奏都不确定（即，对于给定分支没有重要信息）。
                        • -
                      • QI 代表了分支的信息量，与 QC 和 QD 结合使用，以区分具有低信息的分支与具有冲突信息（即高度不一致）的分支。
                        • -
                      -
                        -
                      1. Quartet Fidelity (QF) score - 四重奏保真度分数
                        2. -
                      -
                        -
                      • 对于每个末端分类单元，计算 QF 分数以报告总复制的比例（跨所有分支），包括导致一致四重奏拓扑的给定分类单元。
                        • -
                      • 因此，QF 的使用与“rogue taxon”测试的方法相似。
                        • -
                      • 然而，一个重要的区别是使用分类群完整的引导复制来计算这些分数而不是重新采样的子树，因此在系统发育分析中会遇到与引导得分本身相同的问题（即，当所有引导时，RogueNaRok 算法不会报告rogue分类分数为 100）。
                        • -
                      • 对于给定的分类单元，QF 分数在 [0,1] 范围，作为涉及与焦点树分支一致的分类单元的四重拓扑的比例。
                        • -
                      • 因此，QF 值为 1 表示当一个给定的分类单元在四重奏中采样时，总是在所有内部分支中产生一致的拓扑结构。
                        • -
                      • QF 值接近 0 表明涉及该分类单元的拓扑结构大多不一致，也可能表明序列质量或比对性（identity）较差，或者表明存在使系统无序的特定的谱系，或者分类单元在给定树中明显错位。
                        • -
                      • 请注意，QF 与 QC、QD 和 QI 的具体不同之处在于它是跨内部分支评估的特定分类单元的评估，而不是内部分支的评估。
                        • -
                      -

                      1.2. 程序

                      主要包含以下几个脚本：

                      -
                        -
                      1. pysrc/quartet_sampling.py：主程序，用于实现Quartet Sampling（QS）方法。
                        2. -
                      2. pysrc/merge_output.py：合并quartet_sampling.py程序的输出文件RESULT.node.scores.csv，当使用同一拓扑树运行多次时，用这个脚本合并多次运行的结果到一套结果。
                        3. -
                      3. pysrc/query_tree.py：树查询脚本，从运行后注释好的大型树中找到特定节点。
                        4. -
                      4. pysrc/utils/calc_qstats.py：用于对quartet_sampling.py程序的输出文件RESULT.node.scores.csv进行基础统计。
                        5. -
                      5. pysrc/utils/fasta2phy.py：用于把fasta格式序列转换成relaxed phylip格式。
                        6. -
                      -

                      1.3. 安装

                      无需安装，在已安装python3和RAxML的基础上，脚本可直接运行。

                      -

                      1.4. quartet_sampling.py程序

                      quartet_sampling.py脚本用于进行Quartet Sampling（QS）计算。

                      -

                      1.4.1. 输入

                      拓扑树和比对序列中的样品名称必须一致和对应。可以有多余的序列（拓扑树上没有的），程序会忽略；但不能有拓扑树上出现但缺失序列的情况。

                      -
                        -
                      1. 拓扑树(sample.tre)
                        2. -
                      -
                        -
                      • newick格式
                        • -
                      • 不需要枝长数据，如果有会被忽略
                        • -
                      • 建议去除方括号和方括号内的支持率
                        • -
                      -
                        -
                      1. 比对好的序列(sample_aligned.phy)
                        2. -
                      -
                        -
                      • relaxed phylip格式
                        • -
                      • DNA核酸序列或者氨基酸序列，如果是氨基酸序列在参数中加上--amino-acid
                        • -
                      • utils/fasta2phy.py脚本可以把fasta格式转为relaxed phylip格式
                        • -
                      -
                        -
                      1. partition分区文件【可选】
                        2. -
                      -
                        -
                      • 是可选的输入文件
                        • -
                      • RAxML格式
                        • -
                      • 用作串联比对序列的分区，或者用作单基因树的基因分区。
                        • -
                      • 如果序列稀疏到某些分区包含空序列，建议用--ignore-error参数忽略空分区造成的RAxML错误。
                        • -
                      -

                      1.4.2. 运行

                        -
                      1. 运行命令
                        2. -
                      -
                        -
                      • python3 quartet_sampling.py --tree sample.tre --align sample_aligned.phy --reps 1000 --threads 4 --lnlike 2 --verbout
                        • -
                      -
                        -
                      1. 参数
                        2. -
                      -
                        -
                      • –tree：必需，指定拓扑树
                        • -
                      • –align：必需，指定aligned序列
                        • -
                      • –reps：必需，每个枝计算的重复次数，默认100，推荐1000
                        • -
                      • –threads：必需，每个枝的重复的平行运算的线程，默认1
                        • -
                      • –lnlike：log-likelihood阈值，默认2。用来指定最好似然树超过第二好似然树的最小差异（对每个枝来说）。推荐指定，如果不指定，则调用简单模式，用RAxML从比对序列推断树，不评估似然值，所有枝上的QI分数为0。
                        • -
                      • –data-type：指定数据类型，默认nuc，可选amino，cat
                        • -
                      • –engine：指定推断树和评估树模型似然值的软件，默认raxml-ng，可选raxml，paup，iqtree
                        • -
                      • –partitions：指定分区文件（RAxML格式）。
                        • -
                      • –genetrees：指定分区文件，用分区文件划分比对好的序列成分离的基因树区域。
                        • -
                      • –ignore-errors：忽略RAxML和PAUP运行错误。
                        • -
                      • –clade：执行CSV taxon list指定的特定枝的分析。
                        • -
                      • –calc-qdstats：实验性参数，为QD树频率做卡方检验。只有脚本可用的时候才能用。
                        • -
                      • –result-prefix：指定结果文件前缀
                        • -
                      • –verbose：指定后提供更详尽的输出，生成RESULT.verbose文件。
                        • -
                      • –verbout：指定后提供每个topology和QC的频率的输出，生成RESULT.verbout文件。
                        • -
                      • –min-overlap 20000：在四分体中所有类群被采样需要的最少位点数，默认不设置，推荐20000。
                        • -
                      -
                        -
                      1. 速度
                        2. -
                      -
                        -
                      • 速度很快，6Mb多的snp序列数据40分钟跑完。
                        • -
                      -

                      1.4.3. 结果文件

                        -
                      1. RESULT.node.scores.csv
                        2. -
                      -
                        -
                      • csv格式文件，包含以下信息：
                        • -
                      • node_label
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.node.counts.csv
                        2. -
                      -
                        -
                      • tsv格式文件，包含以下信息：
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.labeled.tre
                        2. -
                      -
                        -
                      • 一棵newick树，每个中间枝都含有QS##标识符
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.labeled.tre.freq/qc/qd/qi
                        2. -
                      -
                        -
                      • 一棵newick树，每个中间枝都含有一致性重复频率(frequency of concordant replicates)/QC/QD/QI分数标识符
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.labeled.tre.figtree
                        2. -
                      -
                        -
                      • FigTree格式的树，包含所有QS分数和中间枝的QC/QD/QI分数。
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.run.stats
                        2. -
                      -
                        -
                      • 记录了nonoverlapping_count
                        • -
                      -
                        -
                      1. RESULT.verbout
                        2. -
                      -
                        -
                      • csv格式文件，每个topology和QC的频率，标题行是topo1,topo2,topo3,topou,qc,qd,qi。
                        • -
                      -

                      1.5. calc_qstats.py程序

                        -
                      1. 运行
                        2. -
                      -
                        -
                      • /path/to/pysrc/utils/calc_qstats.py --data RESULT.node.scores.csv
                        • -
                      -
                        -
                      1. 输出
                        2. -
                      -
                      data read
                      29 26
                      QC
                      Mean (IQR)
                      0.54 (0.31,0.94)
                      QD
                      Mean (IQR)
                      0.13 (0.0,0.14)
                      QI
                      Mean (IQR)
                      1.0 (1.0,1.0)
                      QF
                      Mean (IQR)
                      0.8 (0.78,0.84)
                      - -

                      2. 可视化脚本QS_visualization

                      Quartet Sampling开发者推荐了一个可视化脚本https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization，直接在quartet_sampling.py生成的结果目录下运行R脚本plot_QC_ggtree.R即可得到用于出版的结果。

                      -

                      这个脚本调用ggtree和ggplot2来画图，可以根据需要自行修改参数画图。

                      -
                        -
                      1. 运行plot_QC_ggtree.R
                        2. -
                      -
                        -
                      • 在Linux环境中运行Rscript plot_QC_ggtree.R
                        • -
                      • 在Windows的Rstudio中运行source("plot_QC_ggtree.R")
                        • -
                      -
                        -
                      1. 结果文件
                        2. -
                      -
                        -
                      • 00.treeQC_rect_circ.pdf：可视化结果，一共三页，三张图。
                        • -
                      • tree_qc/qd/qi.tre：把quartet_sampling.py生成的RESULT.labeled.tre.qc/qd/qi结果改格式生成的newick树文件，QC/QD/QI值作为节点标签。
                        • -
                      -

                      00.treeQC_rect_circ.pdf示例文件：https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization/blob/f2a08588d2f5cd40ce952ef4cad2f7f55144e28f/00.treeQC_rect_circ.pdf

                      -
                        -
                      1. plot_QC_ggtree.R脚本
                        2. -
                      -
                      list.files()

                      library(ggtree)
                      library(treeio)
                      library(ggplot2)
                      library(ape)

                      qc <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qc")
                      qd <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qd")
                      qi <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qi")


                      # process node labels of above three labeled trees
                      # qc tree
                      tree <- qc
                      tree$node.label <- gsub("qc=","",tree$node.label)
                      View(tree$node.label)
                      write.tree(tree,"tree_qc.tre")
                      # qd tree
                      tree <- qd
                      tree$node.label <- gsub("qd=","",tree$node.label)
                      View(tree$node.label)
                      write.tree(tree,"tree_qd.tre")
                      # qi tree
                      tree <- qi
                      tree$node.label <- gsub("qi=","",tree$node.label)
                      View(tree$node.label)
                      write.tree(tree,"tree_qi.tre")


                      # read 3 modified tree files for QC/QD/QI
                      tree_qc <- read.newick("tree_qc.tre", node.label='support')
                      tree_qd <- read.newick("tree_qd.tre", node.label='support')
                      tree_qi <- read.newick("tree_qi.tre", node.label='support')


                      # add a customized label for internode or inter-branch, i.e., qc/qd/qI
                      score_raw = paste(tree_qc@data$support,"/",tree_qd@data$support,"/",tree_qi@data$support,sep="")
                      score = gsub("NA/NA/NA","",score_raw)
                      score = gsub("NA","-",score)
                      View(score)


                      # set labeled QC tree as the main plot tree
                      tree <- tree_qc
                      tree@data$score <- score


                      #####################################################
                      # Partitioning quartet concordance. QC values were divided into four categories and this
                      # information was used to color circle points. 

                      # drop the internodes without QC vaule
                      root <- tree@data$node[is.na(tree@data$support)]

                      pdf(file="00.treeQC_rect_circ.pdf", width = 16, height = 18)

                      # (1)color circle points
                      ggtree(tree, size=0.5) +
                        geom_tiplab(size=2) + xlim(0, 0.12) +
                        geom_nodepoint(aes(subset=!isTip & node != root, fill=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))),
                                       shape=21, size=4) +
                        theme_tree(legend.position=c(0.9, 0.18)) +
                        scale_fill_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                          guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                          breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                          labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))

                      # (2)color branch
                      ggtree(tree, aes(color=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))), layout="circular", size=1) +
                        theme_tree(legend.position=c(0.85, 0.24)) +
                        scale_colour_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                            breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                            na.translate=T, na.value="gray",
                                            guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                            labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))

                      # (3)color circle points and label each internode with QC/QD/QI
                      ggtree(tree, size=0.5) +
                        geom_tiplab(size=2) + xlim(0, 0.12) +
                        geom_nodepoint(aes(subset=!isTip & node != root, fill=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))),
                                       shape=21, size=4) +
                        theme_tree(legend.position=c(0.9, 0.18)) +
                        scale_fill_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                          guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                          breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                          labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))+
                        geom_text(aes(label=score, x=branch), size=2, vjust=-.5)

                      dev.off()
                      - -

                      3. 案例

                      -

                      4. references

                        -
                      1. Quartet Sampling软件github：https://github.com/fephyfofum/quartetsampling
                        2. -
                      2. paper：https://bsapubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajb2.1016
                        3. -
                      3. https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization
                        4. -
                      -
                      -
                        -
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                      • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
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                      -]]>                       - - bioinfo - phylogeny - - - phylogeny - phylogenomics - phylogenetic discordance - Quartet Sampling - -                       - - 估算系统树分歧时间 —— paml.mcmctree,r8s - /2021/03/25/bioinfo_phylogeny_caculate.divergence.time/ - - -

                      估算分歧时间是在已经建好物种的系统发育树，根据系统发育树上已知类群间分化时间（一般来自化石或者其他研究的标定），或者根据权威研究中对特定类群的碱基替换速率的估计（例如蕨类4.79e-9 subst./syn. site/year，水稻2.5e-8 subst./syn. site/year)进行估算系统发育树上其他类群的分歧时间。

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                      一般来说，我们尽量使用化石证据的时间（更可靠），可以在网站timetree搜索化石或者其他文章标定的类群分化时间；实在没有化石可用时，则使用碱基替换速率常数。

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                      1. 原理

                      尝试用数学思维讲讲估算分歧时间的原理：即路程=速度*时间，经过多长时间（地质时间），通过多大的速度（碱基替换速率），完成从祖先物种的DNA到现在物种的DNA的变化，总体上的碱基替换积累即路程。

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                      假设下面Figure 1. 系统发育树示意图(A4,(A3,(A2,A1)B)C)D;是有枝长有根树，A1-A4都是现在的物种（代表时间也已知），目的是要估算B和C节点的时间。

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                      Figure 1. 系统发育示意图

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                      • 第一种情况，当已知D节点时间时，求B节点时间（C节点同理）
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                      由于A1的时间点已知（即现在），那么从D到A1的时间跨度是已知的；从D到A1的枝长是已知的，枝长代表的是这个过程的碱基替换数量，即路程；时间和路程已知，我们可以算出速度；同时，从D到B的路程也是已知的（因为枝长已知），那么在假设匀速的前提下，我们也可以算出从D到B的时间，这样即可标定B（即A1和A2分歧时间）的时间。

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                      • 第二种情况，当已知速度（碱基替换速率，常数）时，求B节点时间
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                      由于从B到A1的枝长是已知的，枝长代表的是这个过程的碱基替换数量，即路程；速度已知，那么我们可以算得B到A1的时间跨度，由于A1的时间即现在，时间跨度就是B节点的时间。

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                      以上解释是非常简化的理解这个估算过程，实际情况复杂得多，物种不会匀速进行碱基替换，所以软件会使用算法进行精细化估算。

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                      2. 估算分歧时间常用软件

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                      • beast：Linux也调用图形界面
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                      • paml的mcmctree：推荐
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                      • r8s：非常快
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                        由于从B到A1的枝长是已知的，枝长代表的是这个过程的碱基替换数量，即路程；速度已知，那么我们可以算得B到A1的时间跨度，由于A1的时间即现在，时间跨度就是B节点的时间。

                        +

                        以上解释是非常简化的理解这个估算过程，实际情况复杂得多，物种不会匀速进行碱基替换，所以软件会使用算法进行精细化估算。

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                        2. 估算分歧时间常用软件

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                        • beast：Linux也调用图形界面
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                        • paml的mcmctree：推荐
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                        • r8s：非常快

                        3. paml的mcmctree估算分歧时间

                        3.1. paml介绍

                        PAML (Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood)，是杨子恒开发的一款利用DNA或Protein数据使用最大似然法进行系统发育分析的软件。

                        注意事项：

                        @@ -5567,6 +5233,105 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 r8s + + 树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）可视化物种树和基因树的RF距离 + /2023/03/13/bioinfo_phylogeny_MDS/ + + +

                        1. 树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）可视化物种树和基因树的RF距离

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                        1. 简介
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                        • 当系统发育拓扑冲突时，需要评估基因树与物种树的不一致程度，可使用树空间的多维缩放（multidimensional scaling，MDS）来对树的RF距离进行降维，并在指定维度可视化基因树与物种树之间的RF距离。
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                        1. 分析步骤
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                        • 先使用R包ape 5.0计算树之间的成对Robinson-Foulds（RF）距离，然后对RF距离进行多维缩放（multidimensional scaling，MDS），最后绘制指定维度下的RF距离示意图。
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                        1. 结果
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                        • MDS的二维图如下所示，图中的物种树，包括不同数据和不同软件的物种树（包括ASTRAL_tree，SCGs_ML，SNPs_ML，Plastome_ML树）用其他颜色标示，每个蓝色的点代表一棵基因树，颜色深浅代表支持率平均值的大小。
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                        图 1. MDS二维图示例

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                        2. 分析过程

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                        1. 输入文件
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                        • species_genes.tre：物种树和基因树合并的树文件，可以合并多棵物种树（比如用不同算法和数据构建的树）。
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                        1. 用R包ape计算基因树成对间的Robinson-Foulds（RF）距离
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                        +
                        library(ape) # 载入ape包
                        trees<-read.tree("species_genes.tre") # 读取树
                        trees_dist<-dist.topo(trees, method = "PH85") # 计算RF，trees_dist的数据类别是dist
                        trees_matric<-as.matrix(trees_dist) # 转化dist到矩阵matrix
                        write.table (trees_matric, file ="RF_pairs.tsv", sep ="\t") # 保存矩阵数据到RF_pairs.tsv文件
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                        • RF_pairs.tsv文件是行和列都是tree1,tree2,…,treen等依次命名的树之间的RF距离矩阵。
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                        1. MDS多维缩放
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                        • 经典MDS法
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                        mds <- cmdscale(trees_dist, eig=TRUE, k=2) # k代表维度
                        mds.var.per <- round(mds$eig/sum(mds$eig)*100,1)
                        mds.values <- mds$points
                        mds.data <- data.frame(Sample=rownames(mds.values), X=mds.values[,1], Y=mds.values[,2])
                        write.table(mds.data,file="mds.tsv",sep="\t") # 把MDS的二维值保存到mds.tsv
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                        • mds.tsv文件示例。每棵树都有一行数据，这里是二维的，包含MDS1和MDS2两个值。用tree1,tree2,…,treen等依次命名，与species_genes.tre树文件中树的顺序一致。如果合并了物种树和基因树，可以依据顺序在mds.tsv中找到物种树对应的行。
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                        "Sample"	"MDS1"	"MDS2"
                        "tree1"	"tree1"	-15.2853071675022	-9.23665453167777
                        "tree2"	"tree2"	-13.8416686613703	-7.78853307096205
                        + +
                          +
                        • nonmetric MDS法
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                        +
                        library(MASS)
                        mds <- isoMDS(trees_dist, k=2) # k代表维度
                        + +
                          +
                        1. 绘图
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                        +
                        library(ggplot2)
                        ggplot(data=mds.data, aes(x=X, y=Y, label=Sample))+
                          geom_text() +
                          xlab(paste("MDS1 - ", mds.var.per[1], "%", sep=""))+
                          ylab(paste("MDS2 - ", mds.var.per[2], "%", sep=""))+
                          theme_bw()+
                          ggtitle("MDS plot using Euclidean distance")
                        + +

                        或者

                        +
                        mds <- cmdscale(trees_dist, eig=TRUE, k=2) # k代表维度
                        x <- mds$points[,1]
                        y <- mds$points[,2]
                        plot(x, y, xlab="Coordinate 1", ylab="Coordinate 2", main="Metric MDS", type="n")
                        text(mds$points, labels = rownames(trees_matric), cex = 0.6)
                        + +

                        结果图保存成pdf后可以在pdf编辑器里把物种树对应的点用更大尺寸和其他颜色标示出来。

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                          +
                        1. 建议
                          2. +
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                          +
                        • 还可以把每个基因树和物种树的支持率的平均值计算出来之后，用支持率给每棵树的MSD点上色，从而查看是否是离物种树越近的基因树的平均支持率越高。
                          • +
                        • 也可以用基因树的平均支持率和基因树离物种树的RF距离画散点图，并做线性回归分析判断相关性。
                          • +
                        +

                        3. references

                          +
                        1. MDS paper：https://academic.oup.com/sysbio/article/67/3/400/4175806
                          2. +
                        +
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                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                          • +
                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                          • +
                        +]]>                         + + bioinfo + phylogeny + + + phylogeny + ggplot2 + R packages + multidimensional scaling + MDS + 成对Robinson-Foulds距离 + ape + gene tree + species tree + +                         用R包MSCquartets评估不完全谱系分选的程度 /2023/03/13/bioinfo_phylogeny_MSCquartets/ @@ -5640,104 +5405,343 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                      • 参数
                      -
                    • rqt：quartetTableResolved函数生成的已解决四分体的计数表。列数为(n choose 4)x(n+3)。
                      • -
                    • bigweights：默认为infinite，可设置成finite。表示只有一种拓扑结构的四分体的weight（internal edge length）是无限的（infinite）的值，还是有限的（finite）但很大的数值给出。如果设置成finite，，当一组4个类群的四分体计数为(m,0,0)时，那么边缘权重（edge weight）的计算方法是：主导拓扑结构的相对频率为m/(m+1)。
                      • +
                    • rqt：quartetTableResolved函数生成的已解决四分体的计数表。列数为(n choose 4)x(n+3)。
                      • +
                    • bigweights：默认为infinite，可设置成finite。表示只有一种拓扑结构的四分体的weight（internal edge length）是无限的（infinite）的值，还是有限的（finite）但很大的数值给出。如果设置成finite，，当一组4个类群的四分体计数为(m,0,0)时，那么边缘权重（edge weight）的计算方法是：主导拓扑结构的相对频率为m/(m+1)。
                      • +
                    +
                      +
                    1. 结果
                      2. +
                    +
                      +
                    • 一个(n choose 4)×(n+1)的矩阵，包含用1,1,-1,-1为类群列编码的支配地位四分体拓扑。第(n+1)列”weight”包含MSC下的四个类群的树的四分体的中心边缘长度的最大似然估计，溯祖单位。
                      • +
                    +

                    3.4. quartetTreeTest

                      +
                    1. quartetTreeTest函数用于测试在MSC下四分体计数拟合一棵物种树的假设检验
                      2. +
                    2. 用法：quartetTreeTest(obs,model="T3",lambda=0,method="MLest",smallcounts="approximate",bootstraps=10^4)
                      3. +
                    3. 参数
                      4. +
                    +
                      +
                    • obs：已解决四分体频率的3个计数向量（三个数字组成的向量）
                      • +
                    • model：假设检验的模型，T1用于指定的一棵物种树的四分体拓扑，T3代表任何物种树四分体拓扑。
                      • +
                    • lambda：power-divergence统计参数，0代表似然率统计，1代表卡方检验（Chi-squared）统计
                      • +
                    • method：可选MLtest，conservative或者bootstrap
                      • +
                    • smallcounts：当有些计数很小时，获取p值的方法，可选bootstrap或者approximate
                      • +
                    • bootstraps：bootstrapping采样的数量
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                    +
                      +
                    1. 其他参数细节描述：
                      2. +
                    +
                      +
                    • 这个函数实现了Mitchell等人（2019）给出的两个版本的测试，以及 参数boostrapping，当一些预期计数较小时，还有其他程序。当 拓扑结构和/或内部四分体分支长度不是由无效假设指定的，这些是 比单自由度的Chi-square测试更准确，后者在理论上是不成立的。在模型的奇异点和边界附近是不合理的。
                      • +
                    • 如果method=”MLtest”，则使用Mitchell等人（2019）第7节中描述的该名称的测试。对于T1和T3模型来说，该测试在四元组物种内部的一个小范围内是略微反保守的。边缘的四分体物种树的小范围内，测试略显反常。虽然该检验在实践中一般表现良好，但它缺乏对 在T1或T3的全部参数空间中缺乏统一的渐进保证。
                      • +
                    • 如果method=”conservative”，则使用Mitchell等人（2019）所描述的保守检验。对于模型T3，它使用1个自由度的Chi-square分布（”最不利 “的方法），而对于模型T1，它使用最小调整的Bonferroni，基于n=1e+6的模拟中预先计算的值。拒绝无效假设，但代价是第二类错误的增加。
                      • +
                    • 如果method=”bootstrap”，那么将根据四元组拓扑结构和内部边缘长度的参数估计进行参数化引导。引导样本的大小是由 bootstrap参数。
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                    • 当一些预期的拓扑结构计数较小时，”MLest “和 “conservative”方法并不合适。参数smallcounts决定了是使用bootstrapping还是更快的其他近似方法。这两种方法都涉及对四元组拓扑结构和内部边缘长度的估计。近似法返回一个预先计算好的p值，通过用1e+6替换最大的观察计数，并进行1e+8的计算，找到了p值。用1e+6代替最大的观察数，并对模型T3进行1e+8的引导。当n足够大（至少是30），一些预期计数较小，四叉树的错误概率较小，bootstrap p值大约与T3或T1的选择以及最大的观察计数无关。
                      • +
                    • 对于T1模型，obs的第一个条目被视为与物种树一致的基因四分体的计数。种树一致的基因四分体。
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                    • 当样本量较小时，如少于30个基因树，应谨慎对待返回的p值。返回的bl值是一个一致的估计值，但不是凝聚单位的内部边缘长度的MLE。虽然一致，但t的MLE是有偏的。我们的一致估计值仍有偏差，但比MLE的偏差小。关于在参数空间存在边界和/或奇异性的情况下处理参数估计的偏差的更多讨论，见Mitchell等人（2019）。
                      • +
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                      +
                    1. 结果
                      2. +
                    +
                      +
                    • 结果是两个值：(p-value,bl)
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                    • p-value是假设检验结果的p值
                      • +
                    • bl是以溯祖为单位的内部边缘长度（internal edge length）的一致性估计，可能是Inf。
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                    +

                    3.5. quartetTreeTestInd

                      +
                    1. quartetTreeTestInd函数用于执行多个独立的MSC下的四分体计数拟合到物种树的假设检验。它是quartetTreeTest函数的多线程版本，quartetTreeTest只做一个假设检验，quartetTreeTestInd则是对所有已解决的四分体都进行假设检验。
                      2. +
                    2. 用法：quartetTreeTestInd(rqt,model="T3",lambda=0,method="MLest",smallcounts="approximate",bootstraps=10^4,speciestree=NULL)
                      3. +
                    3. 参数
                      4. +
                    +
                      +
                    • rqt：已解决四分体频率的计数表（由quartetTableResolved函数或quartetStarTestInd函数生成）
                      • +
                    • model：假设检验的模型，T1用于指定的一棵物种树的四分体拓扑，T3代表任何物种树四分体拓扑。
                      • +
                    • lambda：power-divergence统计参数，0代表似然率统计，1代表卡方检验（Chi-squared）统计
                      • +
                    • method：可选MLtest，conservative或者bootstrap。与quartetTreeTest函数一致。
                      • +
                    • smallcounts：当有些计数很小时，获取p值的方法，可选bootstrap或者approximate
                      • +
                    • bootstraps：bootstrapping采样的数量
                      • +
                    • speciestree：物种树，Newick文本格式，用于T1 test的物种四分体。model=”T1”的必选项，model=”T3”则会忽略这个参数。
                      • +
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                      +
                    1. 结果
                      2. +
                    +
                      +
                    • 如果model=”T3”，输出rqt相同的表，并附加一列”p_T3”。附加列代表每个四分体的p-values。
                      • +
                    • 如果model=”T1”，输出rqt相同的表，并附加两列”p_T1”和”qindex”。”p_T1”代表每个四分体的p-values。”qindex”代表与指定物种树一致的四分体的索引值，1代表物种树上的12|34，2代表13|24，3代表14|23。
                      • +
                    +

                    3.6. quartetStarTestInd

                      +
                    1. quartetStarTestInd函数用于多个独立的MSC下的基因四分体计数拟合一个物种四分体星形树（star tree）的假设检验。它是quartetStarTest的多线程版本。这个函数假设所有四分体都是已解决的。
                      2. +
                    2. 用法：quartetStarTestInd(rqt)
                      3. +
                    3. 参数
                      4. +
                    +
                      +
                    • rqt：已解决的四分体计数表（由quartetTableResolved函数或quartetTreeTestInd函数生成）
                      • +
                    +
                      +
                    1. 结果
                      2. +
                    +
                      +
                    • 与输入的rqt相同的表，附加列”p_star”。附加列代表用于判断是否在一个星形树上拟合进MSC的p-values。
                      • +
                    +

                    3.7. quartetTestPlot

                      +
                    1. quartetTestPlot函数用于用四分体假设检验的结果（常由quartetTreeTest函数生成）绘制simplex图，simplex图上的点代表所有四分体计数向量，颜色代表拒绝或失败或特定显著水平的拒绝。
                      2. +
                    2. 用法：quartetTestPlot(pTable,test,alpha=0.05,beta=1,cex=1)
                      3. +
                    3. 参数
                      4. +
                    +
                      +
                    • pTable：四分体和p值表（常由quartetTreeTestInd函数，quartetStarTestInd函数或NANUQ函数生成）
                      • +
                    • test：树的零假设使用的模型，选T1或T3
                      • +
                    • alpha：test给出的零假设的树测试的显著性水平
                      • +
                    • beta：零假设检测星形树（star tree）的显著性水平。beta=1代表只有beta<1和pTable的p_star列存在的测试结果才会绘制点。
                      • +
                    • cex：绘制符号尺寸的缩放比例
                      • +
                    +
                      +
                    1. 结果
                      2. +
                    +
                      +
                    • 不输出值，会绘制simplex图。
                      • +
                    +

                    4. references

                      +
                    1. R包MSCquartets的manual：https://cran.r-project.org/web/packages/MSCquartets/MSCquartets.pdf
                      2. +
                    2. R包MSCquartets的paper：https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa868
                      3. +
                    +
                    +
                      +
                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                      • +
                    • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                      • +
                    +]]> + + bioinfo + phylogeny + ILS + + + gene flow + phylogeny + R packages + MSCquartets + ILS + MSC + simplex + + + + 用软件Quartet Sampling来计算分支支持率，评估系统发育树不一致程度，区分强冲突和弱支持 + /2022/11/08/bioinfo_phylogeny_QuartetSampling/ + + + +

                    1. Quartet Sampling（QS）method

                    Quartet Sampling（QS）是为系统发育树量化分支的支持率的一种方法，用于区分植物系统发育树上的强烈拓扑冲突和信息不足（缺乏支持）导致的支持率低，即区分强冲突（不一致）和弱支持（不确定性）。

                    +

                    1.1. 原理

                    1.1.1. 四重采样

                      +
                    1. 对于给定的系统发育树，每个内部枝将树划分为四个不重叠的分类群子集（图A）。
                      2. +
                    2. 这四组分类群（也被称为元-四重奏，meta-quartet）可以以三种拓扑关系存在：与给定拓扑一致的关系，以及两种替代的不一致关系（Replicate 1和Replicate 2）。
                      3. +
                    3. QS方法从四个子集中的每一个子集中重复随机采样一个分类单元，然后基于给定序列数据（完全比对或随机采样的基因分区），评估跨越该特定分支的随机选择的四条序列（即四重奏，quartet）的所有三个可能系统发育拓扑的似然值。
                      4. +
                    4. 对于同一分支采样的所有四重奏，评估这四个采样分类群可以采用的所有三种可能拓扑的可能性。
                      5. +
                    5. 然后记录所有重复中具有最佳可能性的四重拓扑并制成表格。
                      6. +
                    6. 此过程生成一组计数（跨每个分支的所有复制），其中一致或两个不一致关系中的每一个都具有最佳可能性。
                      7. +
                    7. 该过程可以通过评估每个四重奏的完全比对的可能性（即在单矩阵框架中）或通过从多基因或全基因组比对（即在多基因树中）的单个基因/分区比对中随机抽样来执行聚结框架）。
                      8. +
                    + + +

                    图1. 四重采样方法的描述
                    图源：https://bsapubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajb2.1016

                    +

                    1.1.2. 评估分数

                    QS 方法使用这些重新采样的四重树计数来计算焦点树的每个内部分支的三个分数(QC,QD,QI）和评估分类单元的QF分数。

                    +

                    总的来说，这四个分数提供了区分信息一致性（Quartet Concordance，QC），次生进化历史的存在（Quartet Differential，QD），信息量（Quartet Informativeness，QI）和树中单个分类群的可靠性（Quartet Fidelity，QF）的方法。

                    +

                    QS方法把这些影响分开，而不是像系统发育支持的标准测量那样将它们混为一个单一的汇总支持率。

                    +
                      +
                    1. Quartet Concordance (QC) score - 四重奏一致性分数
                      2. +
                    +
                      +
                    • QC分数是一种类似熵的度量，量化了四种分类群的三种拓扑之间的相对支持度。
                      • +
                    • 即支持率在三种拓扑中分配越平均，QC值越接近0；越不均，约远离0。
                      • +
                    • 当频率最高的拓扑与输入树一致时，QC 值在 (0,1] 范围内为正。
                      • +
                    • 当所有四重树与输入树的焦点分支一致时，QC 等于 1。
                      • +
                    • 当其中一个不一致的拓扑是最常见的采样四重奏，QC 值在 [-1,0) 范围内为负。
                      • +
                    • 当所有四重奏树都是两个不一致的系统发育拓扑之一时接近 -1。
                      • +
                    • 当三个拓扑中平均分配时，QC 等于 0（或者如果三个可能中只有两个被注册为在所有复制中具有最佳可能性，则在两个之间平均分配）。
                      • +
                    +
                      +
                    1. Quartet Differential (QD) score - 四重奏差异分数
                      2. +
                    +
                      +
                    • QD分数使用基因渐渗的f和D统计量的逻辑（尽管使用四重拓扑比例，而不是位点频率），并测量两个不一致拓扑的采样比例之间的差异。
                      • +
                    • QD 分数没有具体量化基因渗入，也没有识别基因渗入的分类群，但确实表明一种拓扑的频率高于另一种拓扑。
                      • +
                    • QD 的低值表明在两个不一致的拓扑结构之间存在一个倾向性的拓扑结构，这也可能表明在给定分支上有背景谱系分选之外的有偏（biased）生物过程的，包括混杂变量，例如基因渗入、强烈的异质性、异质碱基组成等。
                      • +
                    • QD 表示支持率在两种替代拓扑上的差异水平，在 [0,1] 范围内变化，值为 1 表示两棵替代拓扑树的比例没有偏斜（skew），值为0 表示采样的所有不一致树仅来自两种替代关系之一。
                      • +
                    +
                      +
                    1. Quartet Informativeness (QI) score - 四重奏信息分数
                      2. +
                    +
                      +
                    • 在给定最佳和次佳的差异阈值的基础上，最佳似然四重树的似然值超过了次优似然值的四重树。这种情况下，QI分数量化了给定分支的复制比例。
                      • +
                    • 该分数表明，当分子数据在拓扑上有效地模棱两可时（即，当三个可能的四重拓扑中的两个或所有三个具有几乎无法区分的似然分数时），重复不被视为一致或不一致。
                      • +
                    • QI在 [0,1] 范围内变化，表示超过阈值的采样四重奏的比例。
                      • +
                    • QI 值为 1 表示所有四重奏都提供信息，而值为 0 表示所有四重奏都不确定（即，对于给定分支没有重要信息）。
                      • +
                    • QI 代表了分支的信息量，与 QC 和 QD 结合使用，以区分具有低信息的分支与具有冲突信息（即高度不一致）的分支。
                      • +
                    +
                      +
                    1. Quartet Fidelity (QF) score - 四重奏保真度分数
                      2. +
                    +
                      +
                    • 对于每个末端分类单元，计算 QF 分数以报告总复制的比例（跨所有分支），包括导致一致四重奏拓扑的给定分类单元。
                      • +
                    • 因此，QF 的使用与“rogue taxon”测试的方法相似。
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                    • 然而，一个重要的区别是使用分类群完整的引导复制来计算这些分数而不是重新采样的子树，因此在系统发育分析中会遇到与引导得分本身相同的问题（即，当所有引导时，RogueNaRok 算法不会报告rogue分类分数为 100）。
                      • +
                    • 对于给定的分类单元，QF 分数在 [0,1] 范围，作为涉及与焦点树分支一致的分类单元的四重拓扑的比例。
                      • +
                    • 因此，QF 值为 1 表示当一个给定的分类单元在四重奏中采样时，总是在所有内部分支中产生一致的拓扑结构。
                      • +
                    • QF 值接近 0 表明涉及该分类单元的拓扑结构大多不一致，也可能表明序列质量或比对性（identity）较差，或者表明存在使系统无序的特定的谱系，或者分类单元在给定树中明显错位。
                      • +
                    • 请注意，QF 与 QC、QD 和 QI 的具体不同之处在于它是跨内部分支评估的特定分类单元的评估，而不是内部分支的评估。
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                    +

                    1.2. 程序

                    主要包含以下几个脚本：

                    +
                      +
                    1. pysrc/quartet_sampling.py：主程序，用于实现Quartet Sampling（QS）方法。
                      2. +
                    2. pysrc/merge_output.py：合并quartet_sampling.py程序的输出文件RESULT.node.scores.csv，当使用同一拓扑树运行多次时，用这个脚本合并多次运行的结果到一套结果。
                      3. +
                    3. pysrc/query_tree.py：树查询脚本，从运行后注释好的大型树中找到特定节点。
                      4. +
                    4. pysrc/utils/calc_qstats.py：用于对quartet_sampling.py程序的输出文件RESULT.node.scores.csv进行基础统计。
                      5. +
                    5. pysrc/utils/fasta2phy.py：用于把fasta格式序列转换成relaxed phylip格式。
                      6. +
                    +

                    1.3. 安装

                    无需安装，在已安装python3和RAxML的基础上，脚本可直接运行。

                    +

                    1.4. quartet_sampling.py程序

                    quartet_sampling.py脚本用于进行Quartet Sampling（QS）计算。

                    +

                    1.4.1. 输入

                    拓扑树和比对序列中的样品名称必须一致和对应。可以有多余的序列（拓扑树上没有的），程序会忽略；但不能有拓扑树上出现但缺失序列的情况。

                    +
                      +
                    1. 拓扑树(sample.tre)
                      2. +
                    +
                      +
                    • newick格式
                      • +
                    • 不需要枝长数据，如果有会被忽略
                      • +
                    • 建议去除方括号和方括号内的支持率
                      • +
                    +
                      +
                    1. 比对好的序列(sample_aligned.phy)
                      2. +
                    +
                      +
                    • relaxed phylip格式
                      • +
                    • DNA核酸序列或者氨基酸序列，如果是氨基酸序列在参数中加上--amino-acid
                      • +
                    • utils/fasta2phy.py脚本可以把fasta格式转为relaxed phylip格式
                      • +
                    +
                      +
                    1. partition分区文件【可选】
                      2. +
                    +
                      +
                    • 是可选的输入文件
                      • +
                    • RAxML格式
                      • +
                    • 用作串联比对序列的分区，或者用作单基因树的基因分区。
                      • +
                    • 如果序列稀疏到某些分区包含空序列，建议用--ignore-error参数忽略空分区造成的RAxML错误。
                      • +
                    +

                    1.4.2. 运行

                      +
                    1. 运行命令
                      2. +
                    +
                      +
                    • python3 quartet_sampling.py --tree sample.tre --align sample_aligned.phy --reps 1000 --threads 4 --lnlike 2 --verbout
                      • +
                    +
                      +
                    1. 参数
                      2. +
                    +
                      +
                    • –tree：必需，指定拓扑树
                      • +
                    • –align：必需，指定aligned序列
                      • +
                    • –reps：必需，每个枝计算的重复次数，默认100，推荐1000
                      • +
                    • –threads：必需，每个枝的重复的平行运算的线程，默认1
                      • +
                    • –lnlike：log-likelihood阈值，默认2。用来指定最好似然树超过第二好似然树的最小差异（对每个枝来说）。推荐指定，如果不指定，则调用简单模式，用RAxML从比对序列推断树，不评估似然值，所有枝上的QI分数为0。
                      • +
                    • –data-type：指定数据类型，默认nuc，可选amino，cat
                      • +
                    • –engine：指定推断树和评估树模型似然值的软件，默认raxml-ng，可选raxml，paup，iqtree
                      • +
                    • –partitions：指定分区文件（RAxML格式）。
                      • +
                    • –genetrees：指定分区文件，用分区文件划分比对好的序列成分离的基因树区域。
                      • +
                    • –ignore-errors：忽略RAxML和PAUP运行错误。
                      • +
                    • –clade：执行CSV taxon list指定的特定枝的分析。
                      • +
                    • –calc-qdstats：实验性参数，为QD树频率做卡方检验。只有脚本可用的时候才能用。
                      • +
                    • –result-prefix：指定结果文件前缀
                      • +
                    • –verbose：指定后提供更详尽的输出，生成RESULT.verbose文件。
                      • +
                    • –verbout：指定后提供每个topology和QC的频率的输出，生成RESULT.verbout文件。
                      • +
                    • –min-overlap 20000：在四分体中所有类群被采样需要的最少位点数，默认不设置，推荐20000。
                      • +
                    +
                      +
                    1. 速度
                      2. +
                    +
                      +
                    • 速度很快，6Mb多的snp序列数据40分钟跑完。
                      • +
                    +

                    1.4.3. 结果文件

                      +
                    1. RESULT.node.scores.csv
                      2. +
                    +
                      +
                    • csv格式文件，包含以下信息：
                      • +
                    • node_label
                    -
                      -
                    1. 结果
                      2. +
                        +
                      1. RESULT.node.counts.csv
                        -
                      • 一个(n choose 4)×(n+1)的矩阵，包含用1,1,-1,-1为类群列编码的支配地位四分体拓扑。第(n+1)列”weight”包含MSC下的四个类群的树的四分体的中心边缘长度的最大似然估计，溯祖单位。
                        • +
                      • tsv格式文件，包含以下信息：
                      -

                      3.4. quartetTreeTest

                        -
                      1. quartetTreeTest函数用于测试在MSC下四分体计数拟合一棵物种树的假设检验
                        2. -
                      2. 用法：quartetTreeTest(obs,model="T3",lambda=0,method="MLest",smallcounts="approximate",bootstraps=10^4)
                        3. -
                      3. 参数
                        4. +
                          +
                        1. RESULT.labeled.tre
                          -
                        • obs：已解决四分体频率的3个计数向量（三个数字组成的向量）
                          • -
                        • model：假设检验的模型，T1用于指定的一棵物种树的四分体拓扑，T3代表任何物种树四分体拓扑。
                          • -
                        • lambda：power-divergence统计参数，0代表似然率统计，1代表卡方检验（Chi-squared）统计
                          • -
                        • method：可选MLtest，conservative或者bootstrap
                          • -
                        • smallcounts：当有些计数很小时，获取p值的方法，可选bootstrap或者approximate
                          • -
                        • bootstraps：bootstrapping采样的数量
                          • +
                        • 一棵newick树，每个中间枝都含有QS##标识符
                          -
                        1. 其他参数细节描述：
                          2. +
                        2. RESULT.labeled.tre.freq/qc/qd/qi
                          -
                        • 这个函数实现了Mitchell等人（2019）给出的两个版本的测试，以及 参数boostrapping，当一些预期计数较小时，还有其他程序。当 拓扑结构和/或内部四分体分支长度不是由无效假设指定的，这些是 比单自由度的Chi-square测试更准确，后者在理论上是不成立的。在模型的奇异点和边界附近是不合理的。
                          • -
                        • 如果method=”MLtest”，则使用Mitchell等人（2019）第7节中描述的该名称的测试。对于T1和T3模型来说，该测试在四元组物种内部的一个小范围内是略微反保守的。边缘的四分体物种树的小范围内，测试略显反常。虽然该检验在实践中一般表现良好，但它缺乏对 在T1或T3的全部参数空间中缺乏统一的渐进保证。
                          • -
                        • 如果method=”conservative”，则使用Mitchell等人（2019）所描述的保守检验。对于模型T3，它使用1个自由度的Chi-square分布（”最不利 “的方法），而对于模型T1，它使用最小调整的Bonferroni，基于n=1e+6的模拟中预先计算的值。拒绝无效假设，但代价是第二类错误的增加。
                          • -
                        • 如果method=”bootstrap”，那么将根据四元组拓扑结构和内部边缘长度的参数估计进行参数化引导。引导样本的大小是由 bootstrap参数。
                          • -
                        • 当一些预期的拓扑结构计数较小时，”MLest “和 “conservative”方法并不合适。参数smallcounts决定了是使用bootstrapping还是更快的其他近似方法。这两种方法都涉及对四元组拓扑结构和内部边缘长度的估计。近似法返回一个预先计算好的p值，通过用1e+6替换最大的观察计数，并进行1e+8的计算，找到了p值。用1e+6代替最大的观察数，并对模型T3进行1e+8的引导。当n足够大（至少是30），一些预期计数较小，四叉树的错误概率较小，bootstrap p值大约与T3或T1的选择以及最大的观察计数无关。
                          • -
                        • 对于T1模型，obs的第一个条目被视为与物种树一致的基因四分体的计数。种树一致的基因四分体。
                          • -
                        • 当样本量较小时，如少于30个基因树，应谨慎对待返回的p值。返回的bl值是一个一致的估计值，但不是凝聚单位的内部边缘长度的MLE。虽然一致，但t的MLE是有偏的。我们的一致估计值仍有偏差，但比MLE的偏差小。关于在参数空间存在边界和/或奇异性的情况下处理参数估计的偏差的更多讨论，见Mitchell等人（2019）。
                          • +
                        • 一棵newick树，每个中间枝都含有一致性重复频率(frequency of concordant replicates)/QC/QD/QI分数标识符
                          -
                        1. 结果
                          2. +
                        2. RESULT.labeled.tre.figtree
                          -
                        • 结果是两个值：(p-value,bl)
                          • -
                        • p-value是假设检验结果的p值
                          • -
                        • bl是以溯祖为单位的内部边缘长度（internal edge length）的一致性估计，可能是Inf。
                          • +
                        • FigTree格式的树，包含所有QS分数和中间枝的QC/QD/QI分数。
                        -

                        3.5. quartetTreeTestInd

                          -
                        1. quartetTreeTestInd函数用于执行多个独立的MSC下的四分体计数拟合到物种树的假设检验。它是quartetTreeTest函数的多线程版本，quartetTreeTest只做一个假设检验，quartetTreeTestInd则是对所有已解决的四分体都进行假设检验。
                          2. -
                        2. 用法：quartetTreeTestInd(rqt,model="T3",lambda=0,method="MLest",smallcounts="approximate",bootstraps=10^4,speciestree=NULL)
                          3. -
                        3. 参数
                          4. +
                            +
                          1. RESULT.run.stats
                            -
                          • rqt：已解决四分体频率的计数表（由quartetTableResolved函数或quartetStarTestInd函数生成）
                            • -
                          • model：假设检验的模型，T1用于指定的一棵物种树的四分体拓扑，T3代表任何物种树四分体拓扑。
                            • -
                          • lambda：power-divergence统计参数，0代表似然率统计，1代表卡方检验（Chi-squared）统计
                            • -
                          • method：可选MLtest，conservative或者bootstrap。与quartetTreeTest函数一致。
                            • -
                          • smallcounts：当有些计数很小时，获取p值的方法，可选bootstrap或者approximate
                            • -
                          • bootstraps：bootstrapping采样的数量
                            • -
                          • speciestree：物种树，Newick文本格式，用于T1 test的物种四分体。model=”T1”的必选项，model=”T3”则会忽略这个参数。
                            • +
                          • 记录了nonoverlapping_count
                          -
                            -
                          1. 结果
                            2. +
                              +
                            1. RESULT.verbout
                              -
                            • 如果model=”T3”，输出rqt相同的表，并附加一列”p_T3”。附加列代表每个四分体的p-values。
                              • -
                            • 如果model=”T1”，输出rqt相同的表，并附加两列”p_T1”和”qindex”。”p_T1”代表每个四分体的p-values。”qindex”代表与指定物种树一致的四分体的索引值，1代表物种树上的12|34，2代表13|24，3代表14|23。
                              • +
                            • csv格式文件，每个topology和QC的频率，标题行是topo1,topo2,topo3,topou,qc,qd,qi。
                            -

                            3.6. quartetStarTestInd

                              -
                            1. quartetStarTestInd函数用于多个独立的MSC下的基因四分体计数拟合一个物种四分体星形树（star tree）的假设检验。它是quartetStarTest的多线程版本。这个函数假设所有四分体都是已解决的。
                              2. -
                            2. 用法：quartetStarTestInd(rqt)
                              3. -
                            3. 参数
                              4. +

                              1.5. calc_qstats.py程序

                                +
                              1. 运行
                                -
                              • rqt：已解决的四分体计数表（由quartetTableResolved函数或quartetTreeTestInd函数生成）
                                • +
                              • /path/to/pysrc/utils/calc_qstats.py --data RESULT.node.scores.csv
                              -
                                -
                              1. 结果
                                2. +
                                  +
                                1. 输出
                                  2. +
                                +
                                data read
                                29 26
                                QC
                                Mean (IQR)
                                0.54 (0.31,0.94)
                                QD
                                Mean (IQR)
                                0.13 (0.0,0.14)
                                QI
                                Mean (IQR)
                                1.0 (1.0,1.0)
                                QF
                                Mean (IQR)
                                0.8 (0.78,0.84)
                                + +

                                2. 可视化脚本QS_visualization

                                Quartet Sampling开发者推荐了一个可视化脚本https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization，直接在quartet_sampling.py生成的结果目录下运行R脚本plot_QC_ggtree.R即可得到用于出版的结果。

                                +

                                这个脚本调用ggtree和ggplot2来画图，可以根据需要自行修改参数画图。

                                +
                                  +
                                1. 运行plot_QC_ggtree.R
                                  -
                                • 与输入的rqt相同的表，附加列”p_star”。附加列代表用于判断是否在一个星形树上拟合进MSC的p-values。
                                  • +
                                • 在Linux环境中运行Rscript plot_QC_ggtree.R
                                  • +
                                • 在Windows的Rstudio中运行source("plot_QC_ggtree.R")
                                -

                                3.7. quartetTestPlot

                                  -
                                1. quartetTestPlot函数用于用四分体假设检验的结果（常由quartetTreeTest函数生成）绘制simplex图，simplex图上的点代表所有四分体计数向量，颜色代表拒绝或失败或特定显著水平的拒绝。
                                  2. -
                                2. 用法：quartetTestPlot(pTable,test,alpha=0.05,beta=1,cex=1)
                                  3. -
                                3. 参数
                                  4. +
                                    +
                                  1. 结果文件
                                    -
                                  • pTable：四分体和p值表（常由quartetTreeTestInd函数，quartetStarTestInd函数或NANUQ函数生成）
                                    • -
                                  • test：树的零假设使用的模型，选T1或T3
                                    • -
                                  • alpha：test给出的零假设的树测试的显著性水平
                                    • -
                                  • beta：零假设检测星形树（star tree）的显著性水平。beta=1代表只有beta<1和pTable的p_star列存在的测试结果才会绘制点。
                                    • -
                                  • cex：绘制符号尺寸的缩放比例
                                    • +
                                  • 00.treeQC_rect_circ.pdf：可视化结果，一共三页，三张图。
                                    • +
                                  • tree_qc/qd/qi.tre：把quartet_sampling.py生成的RESULT.labeled.tre.qc/qd/qi结果改格式生成的newick树文件，QC/QD/QI值作为节点标签。
                                  -
                                    -
                                  1. 结果
                                    2. +

                                    00.treeQC_rect_circ.pdf示例文件：https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization/blob/f2a08588d2f5cd40ce952ef4cad2f7f55144e28f/00.treeQC_rect_circ.pdf

                                    +
                                      +
                                    1. plot_QC_ggtree.R脚本
                                    -
                                      -
                                    • 不输出值，会绘制simplex图。
                                      • +
                                      list.files()

                                      library(ggtree)
                                      library(treeio)
                                      library(ggplot2)
                                      library(ape)

                                      qc <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qc")
                                      qd <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qd")
                                      qi <- read.tree("RESULT.labeled.tre.qi")


                                      # process node labels of above three labeled trees
                                      # qc tree
                                      tree <- qc
                                      tree$node.label <- gsub("qc=","",tree$node.label)
                                      View(tree$node.label)
                                      write.tree(tree,"tree_qc.tre")
                                      # qd tree
                                      tree <- qd
                                      tree$node.label <- gsub("qd=","",tree$node.label)
                                      View(tree$node.label)
                                      write.tree(tree,"tree_qd.tre")
                                      # qi tree
                                      tree <- qi
                                      tree$node.label <- gsub("qi=","",tree$node.label)
                                      View(tree$node.label)
                                      write.tree(tree,"tree_qi.tre")


                                      # read 3 modified tree files for QC/QD/QI
                                      tree_qc <- read.newick("tree_qc.tre", node.label='support')
                                      tree_qd <- read.newick("tree_qd.tre", node.label='support')
                                      tree_qi <- read.newick("tree_qi.tre", node.label='support')


                                      # add a customized label for internode or inter-branch, i.e., qc/qd/qI
                                      score_raw = paste(tree_qc@data$support,"/",tree_qd@data$support,"/",tree_qi@data$support,sep="")
                                      score = gsub("NA/NA/NA","",score_raw)
                                      score = gsub("NA","-",score)
                                      View(score)


                                      # set labeled QC tree as the main plot tree
                                      tree <- tree_qc
                                      tree@data$score <- score


                                      #####################################################
                                      # Partitioning quartet concordance. QC values were divided into four categories and this
                                      # information was used to color circle points. 

                                      # drop the internodes without QC vaule
                                      root <- tree@data$node[is.na(tree@data$support)]

                                      pdf(file="00.treeQC_rect_circ.pdf", width = 16, height = 18)

                                      # (1)color circle points
                                      ggtree(tree, size=0.5) +
                                        geom_tiplab(size=2) + xlim(0, 0.12) +
                                        geom_nodepoint(aes(subset=!isTip & node != root, fill=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))),
                                                       shape=21, size=4) +
                                        theme_tree(legend.position=c(0.9, 0.18)) +
                                        scale_fill_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                                          guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                                          breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                                          labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))

                                      # (2)color branch
                                      ggtree(tree, aes(color=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))), layout="circular", size=1) +
                                        theme_tree(legend.position=c(0.85, 0.24)) +
                                        scale_colour_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                                            breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                                            na.translate=T, na.value="gray",
                                                            guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                                            labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))

                                      # (3)color circle points and label each internode with QC/QD/QI
                                      ggtree(tree, size=0.5) +
                                        geom_tiplab(size=2) + xlim(0, 0.12) +
                                        geom_nodepoint(aes(subset=!isTip & node != root, fill=cut(support, c(1, 0.2, 0, -0.05, -1))),
                                                       shape=21, size=4) +
                                        theme_tree(legend.position=c(0.9, 0.18)) +
                                        scale_fill_manual(values=c("#2F4F4F", "#98F898", "#FFCC99","#FF6600"),
                                                          guide="legend", name="Quartet Concordance(QC)",
                                                          breaks=c("(0.2,1]","(0,0.2]","(-0.05,0]","(-1,-0.05]"),
                                                          labels=expression(QC>0.2, 0 < QC * " <= 0.2", -0.05 < QC * " <= 0", QC <= -0.05))+
                                        geom_text(aes(label=score, x=branch), size=2, vjust=-.5)

                                      dev.off()
                                      + +

                                      3. 案例

                                      4. references

                                        -
                                      1. R包MSCquartets的manual：https://cran.r-project.org/web/packages/MSCquartets/MSCquartets.pdf
                                        2. -
                                      2. R包MSCquartets的paper：https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa868
                                        3. +
                                      3. Quartet Sampling软件github：https://github.com/fephyfofum/quartetsampling
                                        4. +
                                      4. paper：https://bsapubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajb2.1016
                                        5. +
                                      5. https://github.com/ShuiyinLIU/QS_visualization
                                        @@ -5748,16 +5752,12 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 bioinfo phylogeny - ILS - gene flow phylogeny - R packages - MSCquartets - ILS - MSC - simplex + phylogenomics + phylogenetic discordance + Quartet Sampling @@ -6068,136 +6068,19 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 biosoft - phylogeny - R package - evolutionary tree - plot - itol - treeio - ggtree - facet_plot - ggstance - phylogenetic reticulum - geom_taxalink - multiPhylo - ggdensitree - - - - 使用pixy计算群体的pi，dxy，fst - /2023/03/13/bioinfo_population.genetics_pixy/ - - -

                                        1. 用pixy计算群体的pi，dxy，fst

                                        pixy可以基于多组学的vcf格式文件来计算群体的pi，dxy，fst值。

                                        -

                                        1.1. 安装pixy

                                        conda install --yes -c conda-forge pixy
                                        conda install --yes -c bioconda htslib
                                        pixy --help
                                        - -

                                        1.2. 准备vcf文件

                                        pixy需要的vcf文件与只包含snp的vcf文件不同，是同时包含变异位点（variant sites）和非变异位点（invariant sites）的全位点（all sites）文件。

                                        -
                                          -
                                        1. 获取all-sites的vcf文件
                                          2. -
                                        -
                                        gatk --java-options "-Xmx32g" HaplotypeCaller -R ref.fa -I input.bam -O output.g.vcf -ERC GVCF # 生成单个样本gvcf文件
                                        gatk --java-options "-Xmx32g" GenomicsDBImport -V output1.g.vcf -V output2.g.vcf ... --genomicsdb-workspace-path <allsamples_genomicsdb>
                                        for chr in $(cat chr.list);do gatk --java-options "-Xmx32g" GenotypeGVCFs -R ref.fa -V samples.g.vcf -L ${chr} -all-sites -O ${chr}_allsites.vcf.gz;done  # joint-calling这里一定要加参数-all-sites(把non-variant位点也保存到vcf文件中，后面才能进行pixy的分析）。必须使用-L指定染色体，否则有报错风险。耗时步骤。
                                        ls *_allsites.vcf.gz >vcf.list # 把生成的染色体的vcf文件名保存到vcf.list
                                        gatk MergeVcfs -I vcf.list -O samples_allsites.vcf.gz # 合并所有染色体vcf文件到一个vcf文件，耗时步骤
                                        - -
                                          -
                                        1. 分别获取invariant和variant位点，过滤后，再合并
                                          2. -
                                        -
                                        vcftools --gzvcf samples_allsites.vcf.gz --max-maf 0 --minQ 30 --max-missing 0.9 --min-meanDP 10 --max-meanDP 43 --remove filter.indv --recode --stdout | bgzip -c > samples_invariant_filtered.vcf.gz & # 提取invariant位点并过滤，同时生成out.log名称的log文件
                                        vcftools --gzvcf samples_allsites.vcf.gz --mac 1 --min-alleles 2 --max-alleles 2 --minQ 30 --max-missing 0.9 --min-meanDP 10 --max-meanDP 43 --remove filter.indv --recode --stdout | bgzip -c > samples_variant_filtered.vcf.gz & # 提取variant位点并过滤，同时也生成out.log名称的log文件，最好与上一步骤分开在两个文件夹运行
                                        tabix samples_invariant_filtered.vcf.gz
                                        tabix samples_variant_filtered.vcf.gz
                                        bcftools concat --allow-overlaps samples_variant.vcf.gz samples_invariant.vcf.gz -O z -o samples_allsites_filtered.vcf.gz # 合并invariant和variant位点到一个文件
                                        - -

                                        1.3. pixy计算dxy，pi和fst

                                          -
                                        1. popfile.txt群体文件
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • popfile.txt文件包含样本个体分组信息，两列内容，tab分隔。第一列样本ID，第二列分组名称（常用物种作为分组依据）。
                                          • -
                                        -
                                        ERS223827   BFS
                                        ERS223759   BFS
                                        ERS223750   BFS
                                        ERS223967   AFS
                                        ERS223970   AFS
                                        ERS223924   AFS
                                        ERS224300   AFS
                                        ERS224168   KES
                                        ERS224314   KES
                                        - -
                                          -
                                        1. 运行
                                          2. -
                                        -
                                        bgzip samples_allsites_filtered.vcf
                                        tabix samples_allsites_filtered.vcf.gz
                                        nohup pixy --stats pi fst dxy --vcf sample_allsites_filtered.vcf.gz --populations popfile.txt --window_size 10000 --n_cores 16 &
                                        - -

                                        1.4. pixy的结果

                                        根据–stats的设定，生成三个统计量的结果文件。

                                        -
                                          -
                                        1. pixy_pi.txt：居群内的核苷酸多样性（nucleotide diversity (pi)）
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • pop：popfile.txt群体文件中群体ID
                                          • -
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • -
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • -
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • -
                                        • avg_pi：window的位点的平均核苷酸多样性。更具体地说，pixy 计算window中所有位点的每个位点的加权平均核苷酸多样性，其中权重由每个位点的基因分型样本数决定。
                                          • -
                                        • no_sites：window中至少具有一种有效基因型的位点总数。此统计信息被提供给用户，不会直接用于任何计算。
                                          • -
                                        • count_diffs：window中所有基因型之间成对差异的原始数量。这是计算 avg_pi 的分子。
                                          • -
                                        • count_comparisons：window中所有基因型之间非缺失成对比较的原始数量（即比较两种基因型且均有效的情况）。这是计算 avg_pi 的分母。
                                          • -
                                        • count_missing：window中所有基因型之间缺失配对比较的原始数量（即比较两种基因型且至少缺失一种的情况）。
                                          • -
                                        -
                                        pop	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_pi	no_sites	count_diffs	count_comparisons	count_missing
                                        BFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	0	6	0
                                        AFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	0	6	0
                                        ... ...
                                        - -
                                          -
                                        1. pixy_dxy.txt：居群间的核苷酸差异（nucleotide divergence (dxy)）
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • pop1：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第一个居群
                                          • -
                                        • pop2：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第二个居群
                                          • -
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • -
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • -
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • -
                                        • avg_dxy：window的平均每个位点的核苷酸差异
                                          • -
                                        • no_sites：window中两个群体中至少具有一种有效基因型的位点总数。此统计信息提供给用户，不会直接用于任何计算。
                                          • -
                                        • count_diffs：所有基因型之间的成对交叉种群差异的原始数量。这是计算 avg_dxy 的分子。
                                          • -
                                        • count_comparisons：window中所有基因型之间非缺失成对交叉种群比较的原始数量（即比较两种基因型且均有效的情况）。这是计算 avg_dxy 的分母。
                                          • -
                                        • count_missing：window中所有基因型之间缺失的成对跨种群比较的原始数量（即两个基因型被比较而至少有一个缺失的情况）。这个统计数字提供给用户，不直接用于任何计算。
                                          • -
                                        -
                                        pop1	pop2	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_dxy	no_sites    count_diffs	count_comparisons	count_missing
                                        BFS	AFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	24	0
                                        CFS	DES	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	24	0
                                        - -
                                          -
                                        1. pixy_fst.txt：Weir and Cockerham’s FST
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • pop1：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第一个居群
                                          • -
                                        • pop2：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第二个居群
                                          • -
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • -
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • -
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • -
                                        • avg_wc_fst：window的平均每个SNP（不是每个位点）的 Weir and Cockerham’s FST
                                          • -
                                        • no_snps：window内变异位点（SNPs）的总数
                                          • -
                                        -
                                        pop1	pop2	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_wc_fst	no_snps
                                        BFS	AFS	HiC_scaffold_1	30001	40000	NA	67
                                        CFS	DES	HiC_scaffold_1	30001	40000	0.0	67
                                        - -

                                        结果的后续处理

                                          -
                                        1. 计算平均值的注意事项
                                          2. -
                                        -

                                        值得注意的是，如果想用pixy的结果继续计算更大的window或者整个基因组的平均值不能直接用window的pi/dxy值来计算。

                                        -

                                        正确的计算方法是使用原始计数重新计算differences/comparisons ratios，公式如下：

                                        -

                                        $$(window 1 count_diffs + window 2 count_diffs + … + window n count_diffs) / (window 1 comparisons + window 2 comparisons + … + window n comparisons)$$

                                        -
                                          -
                                        1. 计算整个基因组的pi值
                                          2. -
                                        -
                                        cat pixy_pi.txt |cut -f1,2 |sort|uniq >pops.list
                                        cat pops.list | while read line
                                        do
                                            a=$(echo $line | awk '{print $1}');
                                            b=$(echo $line | awk '{print $2}');
                                            cat pixy_dxy.txt |awk '$1 == "'$a'" && $2 == "'$b'" {suma+=$8;sumb+=$9} END {print "'$a'", "'$b'", suma, sumb, suma/sumb}' >> dxy_average.txt
                                        done
                                        - -
                                          -
                                        1. 计算整个基因组的dxy平均值
                                          2. -
                                        -
                                        cat pixy_dxy.txt |cut -f1 |sort|uniq >pop.list
                                        cat pop.list | while read line
                                        do
                                            a=$(echo $line | awk '{print $1}');
                                            cat pixy_pi.txt |awk '$1 == "'$a'" {suma+=$7;sumb+=$8} END {print "'$a'", suma, sumb, suma/sumb}' >> pi_average.txt
                                        done
                                        - -

                                        结果可视化

                                        2. references

                                          -
                                        1. pixy manual：https://pixy.readthedocs.io/en/latest/index.html
                                          2. -
                                        2. pixy github：https://github.com/ksamuk/pixy
                                          3. -
                                        -
                                        -
                                          -
                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                          • -
                                        -]]>                                         - - bioinfo - population genetics - - - pixy - pi - dxy - fst + phylogeny + R package + evolutionary tree + plot + itol + treeio + ggtree + facet_plot + ggstance + phylogenetic reticulum + geom_taxalink + multiPhylo + ggdensitree                                         @@ -6376,6 +6259,123 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 UFBoot + + 使用pixy计算群体的pi，dxy，fst + /2023/03/13/bioinfo_population.genetics_pixy/ + + +

                                        1. 用pixy计算群体的pi，dxy，fst

                                        pixy可以基于多组学的vcf格式文件来计算群体的pi，dxy，fst值。

                                        +

                                        1.1. 安装pixy

                                        conda install --yes -c conda-forge pixy
                                        conda install --yes -c bioconda htslib
                                        pixy --help
                                        + +

                                        1.2. 准备vcf文件

                                        pixy需要的vcf文件与只包含snp的vcf文件不同，是同时包含变异位点（variant sites）和非变异位点（invariant sites）的全位点（all sites）文件。

                                        +
                                          +
                                        1. 获取all-sites的vcf文件
                                          2. +
                                        +
                                        gatk --java-options "-Xmx32g" HaplotypeCaller -R ref.fa -I input.bam -O output.g.vcf -ERC GVCF # 生成单个样本gvcf文件
                                        gatk --java-options "-Xmx32g" GenomicsDBImport -V output1.g.vcf -V output2.g.vcf ... --genomicsdb-workspace-path <allsamples_genomicsdb>
                                        for chr in $(cat chr.list);do gatk --java-options "-Xmx32g" GenotypeGVCFs -R ref.fa -V samples.g.vcf -L ${chr} -all-sites -O ${chr}_allsites.vcf.gz;done  # joint-calling这里一定要加参数-all-sites(把non-variant位点也保存到vcf文件中，后面才能进行pixy的分析）。必须使用-L指定染色体，否则有报错风险。耗时步骤。
                                        ls *_allsites.vcf.gz >vcf.list # 把生成的染色体的vcf文件名保存到vcf.list
                                        gatk MergeVcfs -I vcf.list -O samples_allsites.vcf.gz # 合并所有染色体vcf文件到一个vcf文件，耗时步骤
                                        + +
                                          +
                                        1. 分别获取invariant和variant位点，过滤后，再合并
                                          2. +
                                        +
                                        vcftools --gzvcf samples_allsites.vcf.gz --max-maf 0 --minQ 30 --max-missing 0.9 --min-meanDP 10 --max-meanDP 43 --remove filter.indv --recode --stdout | bgzip -c > samples_invariant_filtered.vcf.gz & # 提取invariant位点并过滤，同时生成out.log名称的log文件
                                        vcftools --gzvcf samples_allsites.vcf.gz --mac 1 --min-alleles 2 --max-alleles 2 --minQ 30 --max-missing 0.9 --min-meanDP 10 --max-meanDP 43 --remove filter.indv --recode --stdout | bgzip -c > samples_variant_filtered.vcf.gz & # 提取variant位点并过滤，同时也生成out.log名称的log文件，最好与上一步骤分开在两个文件夹运行
                                        tabix samples_invariant_filtered.vcf.gz
                                        tabix samples_variant_filtered.vcf.gz
                                        bcftools concat --allow-overlaps samples_variant.vcf.gz samples_invariant.vcf.gz -O z -o samples_allsites_filtered.vcf.gz # 合并invariant和variant位点到一个文件
                                        + +

                                        1.3. pixy计算dxy，pi和fst

                                          +
                                        1. popfile.txt群体文件
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • popfile.txt文件包含样本个体分组信息，两列内容，tab分隔。第一列样本ID，第二列分组名称（常用物种作为分组依据）。
                                          • +
                                        +
                                        ERS223827   BFS
                                        ERS223759   BFS
                                        ERS223750   BFS
                                        ERS223967   AFS
                                        ERS223970   AFS
                                        ERS223924   AFS
                                        ERS224300   AFS
                                        ERS224168   KES
                                        ERS224314   KES
                                        + +
                                          +
                                        1. 运行
                                          2. +
                                        +
                                        bgzip samples_allsites_filtered.vcf
                                        tabix samples_allsites_filtered.vcf.gz
                                        nohup pixy --stats pi fst dxy --vcf sample_allsites_filtered.vcf.gz --populations popfile.txt --window_size 10000 --n_cores 16 &
                                        + +

                                        1.4. pixy的结果

                                        根据–stats的设定，生成三个统计量的结果文件。

                                        +
                                          +
                                        1. pixy_pi.txt：居群内的核苷酸多样性（nucleotide diversity (pi)）
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • pop：popfile.txt群体文件中群体ID
                                          • +
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • +
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • +
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • +
                                        • avg_pi：window的位点的平均核苷酸多样性。更具体地说，pixy 计算window中所有位点的每个位点的加权平均核苷酸多样性，其中权重由每个位点的基因分型样本数决定。
                                          • +
                                        • no_sites：window中至少具有一种有效基因型的位点总数。此统计信息被提供给用户，不会直接用于任何计算。
                                          • +
                                        • count_diffs：window中所有基因型之间成对差异的原始数量。这是计算 avg_pi 的分子。
                                          • +
                                        • count_comparisons：window中所有基因型之间非缺失成对比较的原始数量（即比较两种基因型且均有效的情况）。这是计算 avg_pi 的分母。
                                          • +
                                        • count_missing：window中所有基因型之间缺失配对比较的原始数量（即比较两种基因型且至少缺失一种的情况）。
                                          • +
                                        +
                                        pop	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_pi	no_sites	count_diffs	count_comparisons	count_missing
                                        BFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	0	6	0
                                        AFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	0	6	0
                                        ... ...
                                        + +
                                          +
                                        1. pixy_dxy.txt：居群间的核苷酸差异（nucleotide divergence (dxy)）
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • pop1：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第一个居群
                                          • +
                                        • pop2：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第二个居群
                                          • +
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • +
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • +
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • +
                                        • avg_dxy：window的平均每个位点的核苷酸差异
                                          • +
                                        • no_sites：window中两个群体中至少具有一种有效基因型的位点总数。此统计信息提供给用户，不会直接用于任何计算。
                                          • +
                                        • count_diffs：所有基因型之间的成对交叉种群差异的原始数量。这是计算 avg_dxy 的分子。
                                          • +
                                        • count_comparisons：window中所有基因型之间非缺失成对交叉种群比较的原始数量（即比较两种基因型且均有效的情况）。这是计算 avg_dxy 的分母。
                                          • +
                                        • count_missing：window中所有基因型之间缺失的成对跨种群比较的原始数量（即两个基因型被比较而至少有一个缺失的情况）。这个统计数字提供给用户，不直接用于任何计算。
                                          • +
                                        +
                                        pop1	pop2	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_dxy	no_sites    count_diffs	count_comparisons	count_missing
                                        BFS	AFS	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	24	0
                                        CFS	DES	HiC_scaffold_1	1	10000	0.0	6	24	0
                                        + +
                                          +
                                        1. pixy_fst.txt：Weir and Cockerham’s FST
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • pop1：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第一个居群
                                          • +
                                        • pop2：popfile.txt群体文件中群体ID，比较的第二个居群
                                          • +
                                        • chromosome：染色体或contig的ID
                                          • +
                                        • window_pos_1：基因组window的起始位置
                                          • +
                                        • window_pos_2：基因组window的终止位置
                                          • +
                                        • avg_wc_fst：window的平均每个SNP（不是每个位点）的 Weir and Cockerham’s FST
                                          • +
                                        • no_snps：window内变异位点（SNPs）的总数
                                          • +
                                        +
                                        pop1	pop2	chromosome	window_pos_1	window_pos_2	avg_wc_fst	no_snps
                                        BFS	AFS	HiC_scaffold_1	30001	40000	NA	67
                                        CFS	DES	HiC_scaffold_1	30001	40000	0.0	67
                                        + +

                                        结果的后续处理

                                          +
                                        1. 计算平均值的注意事项
                                          2. +
                                        +

                                        值得注意的是，如果想用pixy的结果继续计算更大的window或者整个基因组的平均值不能直接用window的pi/dxy值来计算。

                                        +

                                        正确的计算方法是使用原始计数重新计算differences/comparisons ratios，公式如下：

                                        +

                                        $$(window 1 count_diffs + window 2 count_diffs + … + window n count_diffs) / (window 1 comparisons + window 2 comparisons + … + window n comparisons)$$

                                        +
                                          +
                                        1. 计算整个基因组的pi值
                                          2. +
                                        +
                                        cat pixy_pi.txt |cut -f1,2 |sort|uniq >pops.list
                                        cat pops.list | while read line
                                        do
                                            a=$(echo $line | awk '{print $1}');
                                            b=$(echo $line | awk '{print $2}');
                                            cat pixy_dxy.txt |awk '$1 == "'$a'" && $2 == "'$b'" {suma+=$8;sumb+=$9} END {print "'$a'", "'$b'", suma, sumb, suma/sumb}' >> dxy_average.txt
                                        done
                                        + +
                                          +
                                        1. 计算整个基因组的dxy平均值
                                          2. +
                                        +
                                        cat pixy_dxy.txt |cut -f1 |sort|uniq >pop.list
                                        cat pop.list | while read line
                                        do
                                            a=$(echo $line | awk '{print $1}');
                                            cat pixy_pi.txt |awk '$1 == "'$a'" {suma+=$7;sumb+=$8} END {print "'$a'", suma, sumb, suma/sumb}' >> pi_average.txt
                                        done
                                        + +

                                        结果可视化

                                        2. references

                                          +
                                        1. pixy manual：https://pixy.readthedocs.io/en/latest/index.html
                                          2. +
                                        2. pixy github：https://github.com/ksamuk/pixy
                                          3. +
                                        +
                                        +
                                          +
                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                          • +
                                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                          • +
                                        +]]>                                         + + bioinfo + population genetics + + + pixy + pi + dxy + fst + +                                         用PseudogenePipeline鉴定假基因及后续分析 /2022/09/07/bioinfo_pseudogene_PseudogenePipeline/ @@ -7206,6 +7206,67 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 jcvi + + 使用Rldeogram的ideogram函数画两物种的同线性图 + /2022/08/03/bioinfo_synteny_plot_Rldeogram/ + + +

                                        1. 使用Rldeogram的ideogram函数画两物种的共线性图

                                        1.1. 输入文件

                                          +
                                        1. karyotype.txt
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • Chr: 染色体号
                                          • +
                                        • Start: 起始
                                          • +
                                        • End: 终止
                                          • +
                                        • fill: 染色体填充色
                                          • +
                                        • species：物种名
                                          • +
                                        • size: 物种名字体大小
                                          • +
                                        • color: 物种名字体颜色
                                          • +
                                        +

                                        文件示例：

                                        +
                                        Chr Start      End   fill species size  color
                                        1   1 23037639  FF8C00   Grape   12 252525
                                        2   1 18779884  FF8C00   Grape   12 252525
                                        3   1 17934068  FF8C00   Grape   12 252525
                                        4   1 17349521  FF8C00   Grape   12 252525
                                        1   1 22042719  4682B4   Populus   12 252525
                                        2   1 19858802  4682B4   Populus   12 252525
                                        3   1 19278319  4682B4   Populus   12 252525
                                        + +
                                          +
                                        1. synteny.txt
                                          2. +
                                        +
                                          +
                                        • Species_1：物种1染色体号
                                          • +
                                        • Start_1，End_1：物种1染色体区域位置
                                          • +
                                        • Species_2：物种2染色体号
                                          • +
                                        • Start_2，End_2：物种2染色体区域位置
                                          • +
                                        +

                                        文件示例：

                                        +
                                        Species_1  Start_1    End_1 Species_2 Start_2   End_2   fill
                                        1   12226377    12267836    1   5900307 5827251 cccccc
                                        1  5635667 5667377 2 4459512  4393226 cccccc
                                        1   7916366 7945659 3 8618518   8486865 cccccc
                                        2   8214553 8242202 1 5964233  6027199 cccccc
                                        3  2330522 2356593 1 6224069  6138821 cccccc
                                        3  10861038    10886821    2  8099058 8011502 cccccc
                                        4  9487312    9540261    3  7657579 7701112 cccccc
                                        + +

                                        1.2. 运行

                                        install.packages('RIdeogram') #安装RIdeogram
                                        library('RIdeogram') #载入RIdeogram
                                        ka <- read.table("karyotype.txt",sep="\t",header = TRUE,stringsAsFactors = F) #读取karyotype.txt文件
                                        sy <- read.table("synteny.txt",sep="\t",header = TRUE,stringsAsFactors = F) #读取synteny.txt文件
                                        ideogram(karyotype = ka, synteny = sy) #使用ideogram函数，生成chromosome.svg文件用于绘图
                                        convertSVG("chromosome.svg", device = "pdf",dpi=1600) #转化成chromosome.pdf文件，还可选择转化的格式：tiff，png，jpg，分辨率1600。
                                        + +

                                        1.3. 结果

                                        结果如下图：

                                        + + +

                                        Figure 1. Rldeogram绘制的同线性图

                                        +

                                        2. references

                                          +
                                        1. https://www.jianshu.com/p/07ae1fe18071
                                          2. +
                                        +
                                        +
                                          +
                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                          • +
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                                        +]]>                                         + + bioinfo + synteny + plot + + + R package + R + plot + synteny + Rldeogram + ideogram + +                                         分析基因组共线性、计算Ks和鉴定WGD —— WGDI /2021/09/11/bioinfo_synteny_WGDI/ @@ -7524,71 +7585,11 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有

                                        得到all_ks.pdf拟合图

                                        4. references

                                        1. WGDI’s documentation：https://WGDI.readthedocs.io/en/latest/
                                          2. -
                                        2. WGDI’s github：https://github.com/SunPengChuan/wgdi
                                          3. -
                                        3. xuzhougeng’s WGDI上：https://www.jianshu.com/p/a50548e81ac0
                                          4. -
                                        4. xuzhougeng’s WGDI中：https://www.jianshu.com/p/0e4a2807468d
                                          5. -
                                        5. xuzhougeng’s WGDI下：https://www.jianshu.com/p/28a4c3045919
                                          6. -
                                        6. xuzhougeng’s WGDI blockinfo blog：https://www.jianshu.com/p/e97fdcf5d06f
                                          7. -
                                        -
                                        -
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                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                        -]]> - - bioinfo - synteny - - - biosoft - Ks - WGD - synteny - colinearity - WGDI - -                                         - - 使用Rldeogram的ideogram函数画两物种的同线性图 - /2022/08/03/bioinfo_synteny_plot_Rldeogram/ - - -

                                        1. 使用Rldeogram的ideogram函数画两物种的共线性图

                                        1.1. 输入文件

                                          -
                                        1. karyotype.txt
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • Chr: 染色体号
                                          • -
                                        • Start: 起始
                                          • -
                                        • End: 终止
                                          • -
                                        • fill: 染色体填充色
                                          • -
                                        • species：物种名
                                          • -
                                        • size: 物种名字体大小
                                          • -
                                        • color: 物种名字体颜色
                                          • -
                                        -

                                        文件示例：

                                        -
                                        Chr Start      End   fill species size  color
                                        1   1 23037639  FF8C00   Grape   12 252525
                                        2   1 18779884  FF8C00   Grape   12 252525
                                        3   1 17934068  FF8C00   Grape   12 252525
                                        4   1 17349521  FF8C00   Grape   12 252525
                                        1   1 22042719  4682B4   Populus   12 252525
                                        2   1 19858802  4682B4   Populus   12 252525
                                        3   1 19278319  4682B4   Populus   12 252525
                                        - -
                                          -
                                        1. synteny.txt
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • Species_1：物种1染色体号
                                          • -
                                        • Start_1，End_1：物种1染色体区域位置
                                          • -
                                        • Species_2：物种2染色体号
                                          • -
                                        • Start_2，End_2：物种2染色体区域位置
                                          • -
                                        -

                                        文件示例：

                                        -
                                        Species_1  Start_1    End_1 Species_2 Start_2   End_2   fill
                                        1   12226377    12267836    1   5900307 5827251 cccccc
                                        1  5635667 5667377 2 4459512  4393226 cccccc
                                        1   7916366 7945659 3 8618518   8486865 cccccc
                                        2   8214553 8242202 1 5964233  6027199 cccccc
                                        3  2330522 2356593 1 6224069  6138821 cccccc
                                        3  10861038    10886821    2  8099058 8011502 cccccc
                                        4  9487312    9540261    3  7657579 7701112 cccccc
                                        - -

                                        1.2. 运行

                                        install.packages('RIdeogram') #安装RIdeogram
                                        library('RIdeogram') #载入RIdeogram
                                        ka <- read.table("karyotype.txt",sep="\t",header = TRUE,stringsAsFactors = F) #读取karyotype.txt文件
                                        sy <- read.table("synteny.txt",sep="\t",header = TRUE,stringsAsFactors = F) #读取synteny.txt文件
                                        ideogram(karyotype = ka, synteny = sy) #使用ideogram函数，生成chromosome.svg文件用于绘图
                                        convertSVG("chromosome.svg", device = "pdf",dpi=1600) #转化成chromosome.pdf文件，还可选择转化的格式：tiff，png，jpg，分辨率1600。
                                        - -

                                        1.3. 结果

                                        结果如下图：

                                        - - -

                                        Figure 1. Rldeogram绘制的同线性图

                                        -

                                        2. references

                                          -
                                        1. https://www.jianshu.com/p/07ae1fe18071
                                          2. +
                                        2. WGDI’s github：https://github.com/SunPengChuan/wgdi
                                          3. +
                                        3. xuzhougeng’s WGDI上：https://www.jianshu.com/p/a50548e81ac0
                                          4. +
                                        4. xuzhougeng’s WGDI中：https://www.jianshu.com/p/0e4a2807468d
                                          5. +
                                        5. xuzhougeng’s WGDI下：https://www.jianshu.com/p/28a4c3045919
                                          6. +
                                        6. xuzhougeng’s WGDI blockinfo blog：https://www.jianshu.com/p/e97fdcf5d06f
                                          @@ -7599,15 +7600,14 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 bioinfo synteny - plot - R package - R - plot + biosoft + Ks + WGD synteny - Rldeogram - ideogram + colinearity + WGDI @@ -7720,6 +7720,76 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 PlantTFDB + + 结构变异分析软件：Assemblytics + /2022/08/02/bioinfo_variation_SV_Assemblytics/ + + +

                                          1. Assemblytics简介

                                            +
                                          1. Assemblytics在2016年发表在Bioinformatics上，用于检测检测基因组间的结构变异（Structural Variation，SV）。
                                            2. +
                                          2. Assemblytics检测的结构变异主要包括：INDELs，tandem和repeat的expansion和contraction；不包含倒位inversion和易位translocation的检测。
                                            3. +
                                          3. Assemblytics建议使用基因组组装的contigs而非scaffolds，避免Ns对统计结构变异产生影响（假阳性）。
                                            4. +
                                          +Assemblytics + +

                                          Figure 1. variant class and web results interface Assemblytics
                                          图片来源： Assemblytics paper

                                          +

                                          2. Assemblytics使用

                                          Assemblytics的使用很简单，网站也说得清楚明了。

                                          +
                                            +
                                          1. 先用MUMmer把reference genome和query genome比对，得到共线性结果。
                                            2. +
                                          +

                                          nucmer -maxmatch -l 100 -c 500 REFERENCE.fa ASSEMBLY.fa -prefix OUT

                                          +
                                            +
                                          • -l 100：最小匹配长度设置成100
                                            • +
                                          • -c 500：最小匹配序列簇的匹配长度为500
                                            • +
                                          • -prefix OUT：输出结果文件前缀为OUT
                                            • +
                                          +
                                            +
                                          1. 把delta结果文件压缩，压缩后的结果OUT.delta.gz上传到Assemblytics网站。
                                            2. +
                                          +

                                          gzip OUT.delta

                                          +
                                            +
                                          1. 填写参数，提交即可在线运行和得到结果。参数包括：
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • Description：物种名或样品名
                                            • +
                                          • Unique Sequence length required：需要的独特序列长度，代表一个决定用于call variants的序列是否独特的一个锚定（anchor），用于代替读取比对（read alignment）的映射质量的过滤，默认是10000。
                                            • +
                                          • Maximum variant size：最大变异的大小，默认是10000。
                                            • +
                                          • Minimum variant size：最小变异的大小，默认是50。
                                            • +
                                          +

                                          3. 结果

                                          运行结果包括可交互的可视化图的界面和可下载的压缩包。

                                          +

                                          主要结果在文件Assemblytics_structural_variants.summary中，文件内容示例：

                                          +
                                          Insertion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        835          91429
                                               500-10,000 bp:        158         468629
                                                       Total:        993         560058

                                          Deletion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        779          85083
                                               500-10,000 bp:        140         289652
                                                       Total:        919         374735

                                          Tandem_expansion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:         46           8957
                                               500-10,000 bp:        117         444964
                                                       Total:        163         453921

                                          Tandem_contraction
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:          2            379
                                               500-10,000 bp:          0              0
                                                       Total:          2            379

                                          Repeat_expansion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        373          80936
                                               500-10,000 bp:        968        3666087
                                                       Total:       1341        3747023

                                          Repeat_contraction
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        411          92021
                                               500-10,000 bp:        893        3378919
                                                       Total:       1304        3470940

                                          Total number of all variants: 4,722
                                          Total bases affected by all variants: 8.61 Mbp
                                          Total number of structural variants: 4,722
                                          Total bases affected by structural variants: 8.61 Mbp
                                          + +

                                          4. references

                                            +
                                          1. http://assemblytics.com/
                                            2. +
                                          2. https://github.com/marianattestad/assemblytics
                                            3. +
                                          3. paper: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/32/19/3021/2196631
                                            4. +
                                          +
                                          +
                                            +
                                          • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                            • +
                                          • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                            • +
                                          +]]>                                           + + bioinfo + variation + structural variation + + + biosoft + structural variation + SV + insertion + deletion + Indel + tandem expansion + tandem contraction + repeat expansion + repeat contraction + Assemblytics + +                                           结构变异分析软件：MUM&Co /2022/07/17/bioinfo_variation_SV_MUMandCo/ @@ -7848,12 +7918,12 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 structural variation - MUMandCo structural variation SV insertion deletion Indel + MUMandCo duplication contraction inversion @@ -7861,49 +7931,59 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 - 结构变异分析软件：Assemblytics - /2022/08/02/bioinfo_variation_SV_Assemblytics/ - - -

                                          1. Assemblytics简介

                                            -
                                          1. Assemblytics在2016年发表在Bioinformatics上，用于检测检测基因组间的结构变异（Structural Variation，SV）。
                                            2. -
                                          2. Assemblytics检测的结构变异主要包括：INDELs，tandem和repeat的expansion和contraction；不包含倒位inversion和易位translocation的检测。
                                            3. -
                                          3. Assemblytics建议使用基因组组装的contigs而非scaffolds，避免Ns对统计结构变异产生影响（假阳性）。
                                            4. -
                                          -Assemblytics + 结构变异分析 + /2022/10/09/bioinfo_variation_SV_intro/ + -

                                          Figure 1. variant class and web results interface Assemblytics
                                          图片来源： Assemblytics paper

                                          -

                                          2. Assemblytics使用

                                          Assemblytics的使用很简单，网站也说得清楚明了。

                                          +

                                          1. 变异（variation）

                                          不同生物间或者同一种生物不同个体间，染色体上同一位置对应的序列的碱基或者结构不同，或者同一序列在染色体上的位置不同，这种生物间遗传物质的不同被称为变异（variation）。变异是至少两个个体的遗传物质比较的结果。

                                          +

                                          1.1. 变异的类型

                                          基因组上的变异有不同的类型，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），插入缺失（Insertion and Deletion, Indel），和结构变异（structural variation，SV）。

                                            -
                                          1. 先用MUMmer把reference genome和query genome比对，得到共线性结果。
                                            2. +
                                          2. 单核苷酸多态性（SNP）
                                          -

                                          nucmer -maxmatch -l 100 -c 500 REFERENCE.fa ASSEMBLY.fa -prefix OUT

                                            -
                                          • -l 100：最小匹配长度设置成100
                                            • -
                                          • -c 500：最小匹配序列簇的匹配长度为500
                                            • -
                                          • -prefix OUT：输出结果文件前缀为OUT
                                            • +
                                          • 指单个核苷酸的碱基的变化，比如A变成了G，或者C变成了T。
                                            -
                                          1. 把delta结果文件压缩，压缩后的结果OUT.delta.gz上传到Assemblytics网站。
                                            2. +
                                          2. 插入删除（Indel）
                                          -

                                          gzip OUT.delta

                                          +
                                            +
                                          • 指基因组上某个位置发生的较短的线性序列的插入（Insertion）或者删除（Deletion）。插入缺失是两者比较的结果，对一方是插入的，对另一方来说就是删除，所以通常合称为Indel。
                                            • +
                                          • 通常约定插入或缺失长度在50bp以下的被称为Indel，大部分情况下不超过10bp。
                                            • +
                                            -
                                          1. 填写参数，提交即可在线运行和得到结果。参数包括：
                                            2. +
                                          2. 结构变异（SV）
                                            -
                                          • Description：物种名或样品名
                                            • -
                                          • Unique Sequence length required：需要的独特序列长度，代表一个决定用于call variants的序列是否独特的一个锚定（anchor），用于代替读取比对（read alignment）的映射质量的过滤，默认是10000。
                                            • -
                                          • Maximum variant size：最大变异的大小，默认是10000。
                                            • -
                                          • Minimum variant size：最小变异的大小，默认是50。
                                            • +
                                          • 指长片段的序列变化或位置变化，包括长片段的插入删除（Big Indel），染色体倒位（Inversion），易位（Translocation），串联重复（Tandem repeat），拷贝数变异（copy number variation, CNV）等。
                                          -

                                          3. 结果

                                          运行结果包括可交互的可视化图的界面和可下载的压缩包。

                                          -

                                          主要结果在文件Assemblytics_structural_variants.summary中，文件内容示例：

                                          -
                                          Insertion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        835          91429
                                               500-10,000 bp:        158         468629
                                                       Total:        993         560058

                                          Deletion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        779          85083
                                               500-10,000 bp:        140         289652
                                                       Total:        919         374735

                                          Tandem_expansion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:         46           8957
                                               500-10,000 bp:        117         444964
                                                       Total:        163         453921

                                          Tandem_contraction
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:          2            379
                                               500-10,000 bp:          0              0
                                                       Total:          2            379

                                          Repeat_expansion
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        373          80936
                                               500-10,000 bp:        968        3666087
                                                       Total:       1341        3747023

                                          Repeat_contraction
                                                                   Count       Total bp
                                                   50-500 bp:        411          92021
                                               500-10,000 bp:        893        3378919
                                                       Total:       1304        3470940

                                          Total number of all variants: 4,722
                                          Total bases affected by all variants: 8.61 Mbp
                                          Total number of structural variants: 4,722
                                          Total bases affected by structural variants: 8.61 Mbp
                                          +

                                          1.2. 结构变异（structural variation，SV）

                                          1.2.1. 结构变异的定义

                                          结构变异（structural variation，SV）是指基因组上长片段的序列变化和位置关系变化。
                                          过去通常定义为长度大于1000bp的插入删除和倒位，但随着测序的发展，现在的定义更广泛。

                                          +

                                          1.2.2. 结构变异的类型

                                          目前的结构变异通常包括长度大于50bp的长片段序列插入删除（Big Indel），长度大于1000bp的染色体倒位（Inversion），长度大于1000bp的染色体内部或染色体间的序列易位（Translocation），拷贝数变异（copy number variation, CNV），串联重复（Tandem repeat）以及形式更为复杂的嵌合性变异等。

                                          +

                                          有些标准还包括简单重复序列（SSR），散在的重复（Interspersed duplications）和其他重复序列。

                                          +结构变异的类型 + +

                                          图1. 结构变异的类型
                                          图片来源： paper：Genome structural variation discovery and genotyping

                                          +

                                          2. 检测结构变异的方法

                                          检测结构变异的方法主要有四种，包括：

                                          +
                                            +
                                          1. Read-pair (RP)：通过对双端测序reads的距离（即插入序列长度的分布）或位置关系（即双端reads的正反链情况）的异常值分析来检测结构变异。
                                            2. +
                                          2. Split-read (SR)：通过对双端测序reads中一条reads能比对上，另一条不能比对上的情况进行分析来检测结构变异。
                                            3. +
                                          3. Read-depth (RD)：利用read的mapping深度来检测基因组拷贝数变异（Copy number variantion，简称CNV）的方法。
                                            4. +
                                          4. Assembly (AS)：通过三代测序和de novo assembly来检测大长度和复杂结构的变异。
                                            5. +
                                          +

                                          下图总结了四种方法可以检测的结构变异的类型。

                                          +结构变异的检测方法 +

                                          图2. 结构变异的检测方法
                                          图片来源： paper：Genome structural variation discovery and genotyping

                                          +

                                          3. 检测结构变异的软件

                                          检测结构变异的软件有很多，个人用过的两个贴在下面：

                                          +

                                          4. references

                                            -
                                          1. http://assemblytics.com/
                                            2. -
                                          2. https://github.com/marianattestad/assemblytics
                                            3. -
                                          3. paper: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/32/19/3021/2196631
                                            4. +
                                          4. https://en.wikipedia.org/wiki/Structural_variation
                                            5. +
                                          5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/content/overview/#:~:text=Structural%20variation%20(SV)%20is%20generally,copy%20number%20variants%20(CNVs).
                                            6. +
                                          6. SV的检测算法和原理-知乎：https://zhuanlan.zhihu.com/p/40290546
                                            7. +
                                          7. SV的检测算法和原理-文章：https://www.nature.com/articles/nrg2958
                                            8. +
                                          8. SV的检测算法和原理-文章：https://academic.oup.com/bib/article/16/5/852/217239?login=false
                                            @@ -7928,6 +8008,9 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 repeat expansion repeat contraction Assemblytics + MUMandCo + variation + SNP @@ -8294,101 +8377,18 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
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                                          1. 变异（variation）

                                          不同生物间或者同一种生物不同个体间，染色体上同一位置对应的序列的碱基或者结构不同，或者同一序列在染色体上的位置不同，这种生物间遗传物质的不同被称为变异（variation）。变异是至少两个个体的遗传物质比较的结果。

                                          -

                                          1.1. 变异的类型

                                          基因组上的变异有不同的类型，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），插入缺失（Insertion and Deletion, Indel），和结构变异（structural variation，SV）。

                                          -
                                            -
                                          1. 单核苷酸多态性（SNP）
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • 指单个核苷酸的碱基的变化，比如A变成了G，或者C变成了T。
                                            • -
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                                          1. 插入删除（Indel）
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • 指基因组上某个位置发生的较短的线性序列的插入（Insertion）或者删除（Deletion）。插入缺失是两者比较的结果，对一方是插入的，对另一方来说就是删除，所以通常合称为Indel。
                                            • -
                                          • 通常约定插入或缺失长度在50bp以下的被称为Indel，大部分情况下不超过10bp。
                                            • -
                                          -
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                                          1. 结构变异（SV）
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • 指长片段的序列变化或位置变化，包括长片段的插入删除（Big Indel），染色体倒位（Inversion），易位（Translocation），串联重复（Tandem repeat），拷贝数变异（copy number variation, CNV）等。
                                            • -
                                          -

                                          1.2. 结构变异（structural variation，SV）

                                          1.2.1. 结构变异的定义

                                          结构变异（structural variation，SV）是指基因组上长片段的序列变化和位置关系变化。
                                          过去通常定义为长度大于1000bp的插入删除和倒位，但随着测序的发展，现在的定义更广泛。

                                          -

                                          1.2.2. 结构变异的类型

                                          目前的结构变异通常包括长度大于50bp的长片段序列插入删除（Big Indel），长度大于1000bp的染色体倒位（Inversion），长度大于1000bp的染色体内部或染色体间的序列易位（Translocation），拷贝数变异（copy number variation, CNV），串联重复（Tandem repeat）以及形式更为复杂的嵌合性变异等。

                                          -

                                          有些标准还包括简单重复序列（SSR），散在的重复（Interspersed duplications）和其他重复序列。

                                          -结构变异的类型 - -

                                          图1. 结构变异的类型
                                          图片来源： paper：Genome structural variation discovery and genotyping

                                          -

                                          2. 检测结构变异的方法

                                          检测结构变异的方法主要有四种，包括：

                                          -
                                            -
                                          1. Read-pair (RP)：通过对双端测序reads的距离（即插入序列长度的分布）或位置关系（即双端reads的正反链情况）的异常值分析来检测结构变异。
                                            2. -
                                          2. Split-read (SR)：通过对双端测序reads中一条reads能比对上，另一条不能比对上的情况进行分析来检测结构变异。
                                            3. -
                                          3. Read-depth (RD)：利用read的mapping深度来检测基因组拷贝数变异（Copy number variantion，简称CNV）的方法。
                                            4. -
                                          4. Assembly (AS)：通过三代测序和de novo assembly来检测大长度和复杂结构的变异。
                                            5. -
                                          -

                                          下图总结了四种方法可以检测的结构变异的类型。

                                          -结构变异的检测方法 - -

                                          图2. 结构变异的检测方法
                                          图片来源： paper：Genome structural variation discovery and genotyping

                                          -

                                          3. 检测结构变异的软件

                                          检测结构变异的软件有很多，个人用过的两个贴在下面：

                                          - -

                                          4. references

                                            -
                                          1. https://en.wikipedia.org/wiki/Structural_variation
                                            2. -
                                          2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/content/overview/#:~:text=Structural%20variation%20(SV)%20is%20generally,copy%20number%20variants%20(CNVs).
                                            3. -
                                          3. SV的检测算法和原理-知乎：https://zhuanlan.zhihu.com/p/40290546
                                            4. -
                                          4. SV的检测算法和原理-文章：https://www.nature.com/articles/nrg2958
                                            5. -
                                          5. SV的检测算法和原理-文章：https://academic.oup.com/bib/article/16/5/852/217239?login=false
                                            6. -
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                                          Figure 1. 冠群干群示意图
                                          from wikipedia: crown group

                                          +

                                          C1/C2是冠群，S1是干群；C1和S1组成了泛群/总群T1

                                          +

                                          泛群(pan-group)=冠群(crown groups)+干群(stem groups)

                                          +

                                          1. 冠群(crown groups)

                                          在种系遗传学(phylogenetics)中，冠群(crown groups)指的是指定的现存生物群体，和它们的最近共同祖先(the most recent common ancestor,最近共祖)，和最近共祖的所有灭绝后代的物种集合。

                                          +

                                          同时，这也是进化枝(clade)的其中一种定义方式，即某个最近共祖和它的所有后代（包括现存的和灭绝的）的物种集。
                                          如图中红色部分则是两个典型的冠群。

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                                          2. 泛群(Pan-group)

                                          泛群(pan-group)或者总群(total group)是指冠群和比起其他现存生物与冠群更近缘的所有生物的总称。在系统树上，是指冠群和所有回退到与含有现存成员的最近分支分叉的位置(但不包含这个分叉点)的分支。

                                          +

                                          3. 干群(stem groups)

                                          干群(stem groups)是并系类群，由一个泛群中不包括冠群的成员组成。所有干群成员都是灭绝的，多用于古生物学的化石集合。

                                          +

                                          4. 邻群(Plesion-group)

                                          邻群(plesion-group)有几种含义，其中一种是”nearby group”，例如指定类群(可以是冠群，也可以不是)的姐妹群；另一种含义是一个可能是并系的群体，由原始特征(symplesiomorphies，我也不是太明白)定义，通常是指系统发育树的基部类群。
                                          就我们的进化学研究我好像没见过这个词，用的不多。

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                                          5. 词缀

                                          通常要作区分时，把crown-,stem-,pan-,plesion-作为前缀，比如Crown-Aves指现存所有鸟类，以及它们的最近共祖和最近共祖的所有灭绝后代。

                                          +

                                          6. 冠(crown)和干(stem)的在系统发育树上的应用

                                          系统发育树在描述分支节点时，有冠节点和干节点的区别，在标定物种的分化时间时，有冠时间点和干时间点的区别，这个其实是对应冠节点和干节点的，冠节点的时间就是冠时间点。

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                                          用例子说明系统发育树上的冠节点和干节点：

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                                          在下面系统发育树示意图(A4,(A3,(A2,A1)B)C)D中，假设A1和A2都属于As类群，A3和A4不属于As类群，那么在这个系统发育树上，As类群的冠节点是B，干节点是C。当描述As与其他物种分化时间时，冠时间指B点的时间，干时间指C点的时间。

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                                          Figure 2. 系统发育树示意图

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                                          notes：

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                                          每篇博客的周期都有点超出预期吖~

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                                          2021.08.05写完

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                                          ref：

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                                          1. wiki: crown group：https://en.wikipedia.org/wiki/Crown_group
                                            2. +
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                                          • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                          • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
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                                          Figure 1. 冠群干群示意图
                                          from wikipedia: crown group

                                          -

                                          C1/C2是冠群，S1是干群；C1和S1组成了泛群/总群T1

                                          -

                                          泛群(pan-group)=冠群(crown groups)+干群(stem groups)

                                          -

                                          1. 冠群(crown groups)

                                          在种系遗传学(phylogenetics)中，冠群(crown groups)指的是指定的现存生物群体，和它们的最近共同祖先(the most recent common ancestor,最近共祖)，和最近共祖的所有灭绝后代的物种集合。

                                          -

                                          同时，这也是进化枝(clade)的其中一种定义方式，即某个最近共祖和它的所有后代（包括现存的和灭绝的）的物种集。
                                          如图中红色部分则是两个典型的冠群。

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                                          2. 泛群(Pan-group)

                                          泛群(pan-group)或者总群(total group)是指冠群和比起其他现存生物与冠群更近缘的所有生物的总称。在系统树上，是指冠群和所有回退到与含有现存成员的最近分支分叉的位置(但不包含这个分叉点)的分支。

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                                          3. 干群(stem groups)

                                          干群(stem groups)是并系类群，由一个泛群中不包括冠群的成员组成。所有干群成员都是灭绝的，多用于古生物学的化石集合。

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                                          4. 邻群(Plesion-group)

                                          邻群(plesion-group)有几种含义，其中一种是”nearby group”，例如指定类群(可以是冠群，也可以不是)的姐妹群；另一种含义是一个可能是并系的群体，由原始特征(symplesiomorphies，我也不是太明白)定义，通常是指系统发育树的基部类群。
                                          就我们的进化学研究我好像没见过这个词，用的不多。

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                                          5. 词缀

                                          通常要作区分时，把crown-,stem-,pan-,plesion-作为前缀，比如Crown-Aves指现存所有鸟类，以及它们的最近共祖和最近共祖的所有灭绝后代。

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                                          6. 冠(crown)和干(stem)的在系统发育树上的应用

                                          系统发育树在描述分支节点时，有冠节点和干节点的区别，在标定物种的分化时间时，有冠时间点和干时间点的区别，这个其实是对应冠节点和干节点的，冠节点的时间就是冠时间点。

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                                          用例子说明系统发育树上的冠节点和干节点：

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                                          在下面系统发育树示意图(A4,(A3,(A2,A1)B)C)D中，假设A1和A2都属于As类群，A3和A4不属于As类群，那么在这个系统发育树上，As类群的冠节点是B，干节点是C。当描述As与其他物种分化时间时，冠时间指B点的时间，干时间指C点的时间。

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                                          1. 重建祖先序列

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                                          • 根据现存物种的状态（性状/序列），以及系统发育关系，可以推断祖先节点物种的状态（性状/序列），即祖先状态重建。
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                                          • 这篇博客介绍使用PAML的baseML程序根据系统发育关系从现存物种的序列重建祖先序列的用法。
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                                          2. 用PAML的baseML程序重建祖先序列

                                          2.1. 准备输入文件

                                          输入的序列比对文件和树文件的格式可以参考https://github.com/abacus-gene/paml-tutorial/tree/main/positive-selection/00_data 中的 Mx_aln.phy Mx_root.tree，Mx_unroot.tre 文件。

                                          +
                                            +
                                          1. 序列比对文件 (cds_aln.phy)
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • phylip格式
                                            • +
                                          • 比对好的编码序列 (cds) 文件，碱基数量是3的倍数（codon模式比对）
                                            • +
                                          • 建议删除gaps和难以align的区域，但要按密码子删除（删除和保留都是3的倍数个碱基）
                                            • +
                                          +
                                            +
                                          1. 树文件 (tree.newick)
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • newick格式，并在首行前加上一行，包括两个数字，一个是物种/样本数量，一个是树的数量（一般是1），空格隔开。
                                            • +
                                          • 只需要拓扑结构，删除枝长、支持率等信息。
                                            • +
                                          +
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                                          1. 配置文件 (baseml.ctl)
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • baseml.ctl 的例子在安装的程序包paml/examples/下有，可以复制到分析目录下，修改后使用
                                            • +
                                          • 基础的配置参数如下，后续分析可基于这套参数修改：
                                            • +
                                          +
                                          seqfile = aln.phy  * sequence data file name
                                          treefile = tree.newick * tree structure file name
                                          outfile = out.txt * main result file
                                          noisy = 3     * 0,1,2,3: how much rubbish on the screen 控制屏幕输出的信息量
                                          verbose = 0     * 1: detailed output, 0: concise output * 控制输出文件中的信息量
                                          runmode = 0     * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI
                                          model = 6     * 0:JC69, 1:K80, 2:F81, 3:F84, 4:HKY85, 5:T92, 6:TN93, 7:REV, 8:UNREST, 9:REVu; 10:UNRESTu 指定核酸替代模型。模型0,1,…,8分别表示模型JC69， K80， F81， F84， HKY85， T92， TN93， REV (也称为 GTR)， 和 UNREST。注释参看Yang（1994 JME 39:105-111）。两个模型可以分别运行。model = 9是REV模型的特例，而model = 10是无限制模型的特例。当model = 9或10时，同一行里包含的主要是指定模型的额外信息。中括号中的数字是自由参数比值的数字。例如，REV应该是5而UNREST应该是11。接在这些数字后面的是圆括号中的数字。输出文件中的比值参数将按照这里的顺序摆列。括号中没有提到的比值为1。当model = 9时，你只能指定TC或CT，但不能同时指定。当model = 10时，TC和CT是不同的。
                                          Mgene = 0      * 0:rates, 1:separate; 2:diff pi, 3:diff kapa, 4:all diff
                                          ndata = 1      * number of data sets * 基因或比对的数量
                                          clock = 0      * 0:no clock, 1:clock; 2:local clock; 3:CombinedAnalysis
                                          fix_kappa = 0      * 0: estimate kappa; 1: fix kappa at value below
                                          kappa = 2.5      * initial or fixed kappa
                                          fix_alpha = 1      * 0: estimate alpha; 1: fix alpha at value below
                                          alpha = 0.      * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate)
                                          Malpha = 0      * 1: different alpha¡¯s for genes, 0: one alpha
                                          ncatG = 5      * # of categories in the dG, AdG, or nparK models of rates
                                          fix_rho = 1      * 0: estimate rho; 1: fix rho at value below
                                          rho = 0.      * initial or fixed rho, 0:no correlation
                                          nparK = 0      * rate-class models. 1:rK, 2:rK&fK, 3:rK&MK(1/K), 4:rK&MK
                                          nhomo = 0      * 0 & 1: homogeneous, 2: kappa for branches, 3: N1, 4: N2。 nhomo仅针对baseml，并涉及同一替代模型中的频率参数。nhomo = 1适合一个均匀模型，但是通过最大似然迭代估算频率参数（πT，πC和πA；πG在频率总和为1中不是一个自由参数。）。这适用于F81，F84，HKY85，T92（这种情况下πGC是一个参数），TN93，或REV模型。通常（nhomo = 0）这些通过观察到的频率的平均值来估算。在两种情况下（nhomo = 0 和 1），你需要为碱基频率计算三个（或对T92计算一个）自由参数。 nhomo = 2 适用K80，F84和HKY85模型对树中的每个分枝估算一个转换/颠换比率（k）。 选项 nhomo = 3，4，和5仅用于F84，HKY85 或 T92。
                                          getSE = 0      * 0: don¡¯t want them, 1: want S.E.s of estimates
                                          RateAncestor = 1      * (0,1,2): rates (alpha>0) or ancestral states，默认是0，不重构祖先状态，1是重构祖先序列。
                                          Small_Diff = 1e-6
                                          cleandata = 0      * remove sites with ambiguity data (1:yes, 0:no)?  歧义数据和比对间隙的位点要保留(0)或删除(1)，建议自行删除歧义和gaps数据，并在这里选保留(0)。
                                          * icode = 0      * (RateAncestor=1 for coding genes, ¡°GC¡± in data)
                                          * fix_blength = 0      * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed。设置程序处理输入树文件中枝长数据的方法：0，忽略输入树文件中的枝长信息；-1，使用一个随机起始进行进行计算；1，以输入的枝长信息作为初始值进行ML迭代分析，此时需要注意输入的枝长信息是碱基替换率，而不是碱基替换数；2，不需要使用ML迭代计算枝长，直接使用输入的枝长信息，需要注意，若枝长信息和序列信息不吻合可能导致程序崩溃；3，让ML计算出的枝长和输入的枝长呈正比。
                                          method = 0      * 0: simultaneous; 1: one branch at a time
                                          -

                                          Figure 2. 系统发育树示意图

                                          -

                                          notes：

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                                          每篇博客的周期都有点超出预期吖~

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                                          2021.08.05写完

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                                          ref：

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                                          2.2. 执行

                                            +
                                          • 执行命令baseml baseml.ctl
                                            • +
                                          +

                                          2.3. 结果文件

                                          推断的祖先序列在结果文件rst中，与提供的比对好的现存物种序列长度一致，可免比对，直接提取使用。

                                          +

                                          2.3.1. out.txt

                                            +
                                          • 主要结果文件，默认名称是mlc。
                                            • +
                                          • 内容包括每条序列的A/T/C/G的频率，一致性位点数量，成对遗传距离矩阵，Pairwise deletion matrix，带枝长的树，树节点和枝的编号，以及kappa值。

                                            2.3.2. rst：包含三块内容

                                            Marginal reconstruction和Joint reconstruction是两种祖先序列重构的算法。如果对所有分类单元的合集都感兴趣，用joint；如果对特定分类单元的祖先感兴趣，用marginal。
                                            • +
                                            -
                                          1. wiki: crown group：https://en.wikipedia.org/wiki/Crown_group
                                            2. +
                                          2. 运行的参数以及树的信息
                                            3. +
                                          +
                                            +
                                          • 给系统发育树的每个node进行编号的信息，以及每个branch是哪两个node连接而成；
                                            • +
                                          +
                                            +
                                          1. Marginal reconstruction of ancestral sequences的结果
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • Prob of best state at each node, listed by site. 分位点记录的每个node的序列和频率，以及重建的祖先序列的概率；
                                            • +
                                          • Summary of changes along branches. 分branch记录突变的位点；
                                            • +
                                          • List of extant and reconstructed sequences（现存node和祖先node的序列）；
                                            • +
                                          • Overall accuracy of the 91 ancestral sequences
                                            • +
                                          • Counts of changes at sites. 分位点记录突变的计数；
                                            • +
                                          +
                                            +
                                          1. Joint reconstruction of ancestral sequences的结果
                                            2. +
                                          +
                                            +
                                          • Reconstruction (prob.), listed by pattern
                                            • +
                                          • List of extant and reconstructed sequences（现存node和祖先node的序列）；

                                            2.3.3. 其他文件

                                            另外还有一些其他结果文件，暂时还未用到。
                                            • +
                                          +
                                            +
                                          1. rst1
                                            2. +
                                          2. lnf
                                            3. +
                                          3. rub
                                            4. +
                                          +

                                          3. reference

                                            +
                                          1. PAML User Guide：https://github.com/abacus-gene/paml/blob/master/doc/pamlDOC.pdf
                                            2. +
                                          2. PAML 中文用户手册：https://blog.sciencenet.cn/blog-3433349-1241310.html
                                            3. +
                                          3. PAML开发者网站：http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/#phylogenetic-analysis-by-maximum-likelihood-paml
                                            4. +
                                          4. paml软件进行祖先酶序列重建极简教程视频：https://www.bilibili.com/video/BV1AX4y1K7H4/
                                          • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                          • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                          - -]]>                                           +]]>                                           bio - concept + evolution + ancestral state reconstruction - concept - crown groups - stem groups - fossil time + bioinfo + biosoft + PAML + baseML + 祖先状态重建                                           @@ -8819,142 +8915,48 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                        1. 例子
                                          并系类群的例子有苔藓植物，蕨类植物，爬行动物，鱼类，原核生物。
                                          2. -
                                        2. 分类学上的处理
                                          3. -
                                        -
                                          -
                                        • 分类学上对并系类群一般做合并处理。
                                          • -
                                        • 例如传统概念的夹竹桃科（Apocynaceae）是个并系，与萝藦科（Asclepiadaceae）之后的广义夹竹桃科则成为一个单系类群。
                                          • -
                                        -

                                        4. 多系/复系-polyphyly

                                          -
                                        1. 定义
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • 多系是指一个包含的成员来自两个或多个分支，且没有包含所有成员的最近共同祖先的分类群。
                                          • -
                                        • 通过趋同共性被归类到一起的类群。
                                          • -
                                        • 也是由于传统认知偏差造成的非自然类群，但具有共同特征且有科学价值。
                                          • -
                                        • 广泛一点说，任何不适单系或者并系的分类群都可以被称为多系。
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                                        1. 例子
                                          2. -
                                        -
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                                        • 多系类群的例子有果树，水生昆虫，寄生植物，多肉植物，食虫植物等。
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                                        1. 分类学上的处理
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                                        -
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                                        • 分类学上对多系类群一般做拆分处理。
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                                        • 例如传统的毛茛科（Ranunculaceae）是多系类群，包含芍药属（Paeonia），星叶草属（Circaeaster）和狭义的毛茛科，把三个部分拆分，芍药属独立成为芍药科（Paeoniaceae），星叶草属独立成为星叶草科（Circaeasteraceae），狭义的毛茛科依然保持，则成为三个独立的单系类群。
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                                        5. 物种概念中的单系和并系

                                        物种概念要求物种是单系的，但由于部分类群祖征的丢失，并系物种在自然界中很常见。
                                        研究表明，多达20%的动物物种和20%-50%的植物物种是并系的。

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                                        5.1. 一些例子

                                        并系群-排除的单系群-对应的完整单系群

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                                        • 鱼fish-四足类Tetrapoda-脊椎动物Vertebrate
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                                        • 爬行动物Reptiles-鸟类birds-蜥形目Sauropsida
                                          • -
                                        • 猴子Monkey-人猿总科Hominoidea-类人猿目Simiiformes
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                                        6. references

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                                        1. wiki:cladistics：https://en.wikipedia.org/wiki/Cladistics
                                          2. -
                                        2. wiki:monophyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Monophyly
                                          3. -
                                        3. wiki:paraphyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Paraphyly
                                          4. -
                                        4. wiki:polyphyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Polyphyly
                                          5. -
                                        5. ArtemisiaLiu’s weibo：https://www.weibo.com/ttarticle/p/show?id=2309404308383288185230
                                          6. -
                                        6. http://wap.sciencenet.cn/blog-3454407-1262077.html?mobile=1
                                          7. -
                                        -
                                        -
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                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
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                                        -]]>                                         - - bio - concept - - - monophyly - paraphyly - polyphyly - cladistics - -                                         - - 祖先状态重建：用PAML的baseML重建祖先序列 - /2023/11/03/evolution_ancestral.state.reconstruction_paml.baseml/ - - - -

                                        1. 重建祖先序列

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                                        • 根据现存物种的状态（性状/序列），以及系统发育关系，可以推断祖先节点物种的状态（性状/序列），即祖先状态重建。
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                                        • 这篇博客介绍使用PAML的baseML程序根据系统发育关系从现存物种的序列重建祖先序列的用法。
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                                        2. 用PAML的baseML程序重建祖先序列

                                        2.1. 准备输入文件

                                        输入的序列比对文件和树文件的格式可以参考https://github.com/abacus-gene/paml-tutorial/tree/main/positive-selection/00_data 中的 Mx_aln.phy Mx_root.tree，Mx_unroot.tre 文件。

                                        -
                                          -
                                        1. 序列比对文件 (cds_aln.phy)
                                          2. -
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                                          -
                                        • phylip格式
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                                        • 比对好的编码序列 (cds) 文件，碱基数量是3的倍数（codon模式比对）
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                                        • 建议删除gaps和难以align的区域，但要按密码子删除（删除和保留都是3的倍数个碱基）
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                                        1. 树文件 (tree.newick)
                                          2. -
                                        -
                                          -
                                        • newick格式，并在首行前加上一行，包括两个数字，一个是物种/样本数量，一个是树的数量（一般是1），空格隔开。
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                                        • 只需要拓扑结构，删除枝长、支持率等信息。
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                                        1. 配置文件 (baseml.ctl)
                                          2. +
                                        2. 分类学上的处理
                                          -
                                        • baseml.ctl 的例子在安装的程序包paml/examples/下有，可以复制到分析目录下，修改后使用
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                                        • 基础的配置参数如下，后续分析可基于这套参数修改：
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                                        seqfile = aln.phy  * sequence data file name
                                        treefile = tree.newick * tree structure file name
                                        outfile = out.txt * main result file
                                        noisy = 3     * 0,1,2,3: how much rubbish on the screen 控制屏幕输出的信息量
                                        verbose = 0     * 1: detailed output, 0: concise output * 控制输出文件中的信息量
                                        runmode = 0     * 0: user tree; 1: semi-automatic; 2: automatic * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI
                                        model = 6     * 0:JC69, 1:K80, 2:F81, 3:F84, 4:HKY85, 5:T92, 6:TN93, 7:REV, 8:UNREST, 9:REVu; 10:UNRESTu 指定核酸替代模型。模型0,1,…,8分别表示模型JC69， K80， F81， F84， HKY85， T92， TN93， REV (也称为 GTR)， 和 UNREST。注释参看Yang（1994 JME 39:105-111）。两个模型可以分别运行。model = 9是REV模型的特例，而model = 10是无限制模型的特例。当model = 9或10时，同一行里包含的主要是指定模型的额外信息。中括号中的数字是自由参数比值的数字。例如，REV应该是5而UNREST应该是11。接在这些数字后面的是圆括号中的数字。输出文件中的比值参数将按照这里的顺序摆列。括号中没有提到的比值为1。当model = 9时，你只能指定TC或CT，但不能同时指定。当model = 10时，TC和CT是不同的。
                                        Mgene = 0      * 0:rates, 1:separate; 2:diff pi, 3:diff kapa, 4:all diff
                                        ndata = 1      * number of data sets * 基因或比对的数量
                                        clock = 0      * 0:no clock, 1:clock; 2:local clock; 3:CombinedAnalysis
                                        fix_kappa = 0      * 0: estimate kappa; 1: fix kappa at value below
                                        kappa = 2.5      * initial or fixed kappa
                                        fix_alpha = 1      * 0: estimate alpha; 1: fix alpha at value below
                                        alpha = 0.      * initial or fixed alpha, 0:infinity (constant rate)
                                        Malpha = 0      * 1: different alpha¡¯s for genes, 0: one alpha
                                        ncatG = 5      * # of categories in the dG, AdG, or nparK models of rates
                                        fix_rho = 1      * 0: estimate rho; 1: fix rho at value below
                                        rho = 0.      * initial or fixed rho, 0:no correlation
                                        nparK = 0      * rate-class models. 1:rK, 2:rK&fK, 3:rK&MK(1/K), 4:rK&MK
                                        nhomo = 0      * 0 & 1: homogeneous, 2: kappa for branches, 3: N1, 4: N2。 nhomo仅针对baseml，并涉及同一替代模型中的频率参数。nhomo = 1适合一个均匀模型，但是通过最大似然迭代估算频率参数（πT，πC和πA；πG在频率总和为1中不是一个自由参数。）。这适用于F81，F84，HKY85，T92（这种情况下πGC是一个参数），TN93，或REV模型。通常（nhomo = 0）这些通过观察到的频率的平均值来估算。在两种情况下（nhomo = 0 和 1），你需要为碱基频率计算三个（或对T92计算一个）自由参数。 nhomo = 2 适用K80，F84和HKY85模型对树中的每个分枝估算一个转换/颠换比率（k）。 选项 nhomo = 3，4，和5仅用于F84，HKY85 或 T92。
                                        getSE = 0      * 0: don¡¯t want them, 1: want S.E.s of estimates
                                        RateAncestor = 1      * (0,1,2): rates (alpha>0) or ancestral states，默认是0，不重构祖先状态，1是重构祖先序列。
                                        Small_Diff = 1e-6
                                        cleandata = 0      * remove sites with ambiguity data (1:yes, 0:no)?  歧义数据和比对间隙的位点要保留(0)或删除(1)，建议自行删除歧义和gaps数据，并在这里选保留(0)。
                                        * icode = 0      * (RateAncestor=1 for coding genes, ¡°GC¡± in data)
                                        * fix_blength = 0      * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed。设置程序处理输入树文件中枝长数据的方法：0，忽略输入树文件中的枝长信息；-1，使用一个随机起始进行进行计算；1，以输入的枝长信息作为初始值进行ML迭代分析，此时需要注意输入的枝长信息是碱基替换率，而不是碱基替换数；2，不需要使用ML迭代计算枝长，直接使用输入的枝长信息，需要注意，若枝长信息和序列信息不吻合可能导致程序崩溃；3，让ML计算出的枝长和输入的枝长呈正比。
                                        method = 0      * 0: simultaneous; 1: one branch at a time
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                                        2.2. 执行

                                          -
                                        • 执行命令baseml baseml.ctl
                                          • -
                                        -

                                        2.3. 结果文件

                                        推断的祖先序列在结果文件rst中，与提供的比对好的现存物种序列长度一致，可免比对，直接提取使用。

                                        -

                                        2.3.1. out.txt

                                          -
                                        • 主要结果文件，默认名称是mlc。
                                          • -
                                        • 内容包括每条序列的A/T/C/G的频率，一致性位点数量，成对遗传距离矩阵，Pairwise deletion matrix，带枝长的树，树节点和枝的编号，以及kappa值。

                                          2.3.2. rst：包含三块内容

                                          Marginal reconstruction和Joint reconstruction是两种祖先序列重构的算法。如果对所有分类单元的合集都感兴趣，用joint；如果对特定分类单元的祖先感兴趣，用marginal。
                                          • +
                                        • 分类学上对并系类群一般做合并处理。
                                          • +
                                        • 例如传统概念的夹竹桃科（Apocynaceae）是个并系，与萝藦科（Asclepiadaceae）之后的广义夹竹桃科则成为一个单系类群。
                                        -
                                          -
                                        1. 运行的参数以及树的信息
                                          2. +

                                          4. 多系/复系-polyphyly

                                            +
                                          1. 定义
                                            -
                                          • 给系统发育树的每个node进行编号的信息，以及每个branch是哪两个node连接而成；
                                            • +
                                          • 多系是指一个包含的成员来自两个或多个分支，且没有包含所有成员的最近共同祖先的分类群。
                                            • +
                                          • 通过趋同共性被归类到一起的类群。
                                            • +
                                          • 也是由于传统认知偏差造成的非自然类群，但具有共同特征且有科学价值。
                                            • +
                                          • 广泛一点说，任何不适单系或者并系的分类群都可以被称为多系。
                                            -
                                          1. Marginal reconstruction of ancestral sequences的结果
                                            2. +
                                          2. 例子
                                            -
                                          • Prob of best state at each node, listed by site. 分位点记录的每个node的序列和频率，以及重建的祖先序列的概率；
                                            • -
                                          • Summary of changes along branches. 分branch记录突变的位点；
                                            • -
                                          • List of extant and reconstructed sequences（现存node和祖先node的序列）；
                                            • -
                                          • Overall accuracy of the 91 ancestral sequences
                                            • -
                                          • Counts of changes at sites. 分位点记录突变的计数；
                                            • +
                                          • 多系类群的例子有果树，水生昆虫，寄生植物，多肉植物，食虫植物等。
                                            -
                                          1. Joint reconstruction of ancestral sequences的结果
                                            2. +
                                          2. 分类学上的处理
                                            -
                                          • Reconstruction (prob.), listed by pattern
                                            • -
                                          • List of extant and reconstructed sequences（现存node和祖先node的序列）；

                                            2.3.3. 其他文件

                                            另外还有一些其他结果文件，暂时还未用到。
                                            • +
                                          • 分类学上对多系类群一般做拆分处理。
                                            • +
                                          • 例如传统的毛茛科（Ranunculaceae）是多系类群，包含芍药属（Paeonia），星叶草属（Circaeaster）和狭义的毛茛科，把三个部分拆分，芍药属独立成为芍药科（Paeoniaceae），星叶草属独立成为星叶草科（Circaeasteraceae），狭义的毛茛科依然保持，则成为三个独立的单系类群。
                                          -
                                            -
                                          1. rst1
                                            2. -
                                          2. lnf
                                            3. -
                                          3. rub
                                            4. -
                                          -

                                          3. reference

                                            -
                                          1. PAML User Guide：https://github.com/abacus-gene/paml/blob/master/doc/pamlDOC.pdf
                                            2. -
                                          2. PAML 中文用户手册：https://blog.sciencenet.cn/blog-3433349-1241310.html
                                            3. -
                                          3. PAML开发者网站：http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/#phylogenetic-analysis-by-maximum-likelihood-paml
                                            4. -
                                          4. paml软件进行祖先酶序列重建极简教程视频：https://www.bilibili.com/video/BV1AX4y1K7H4/
                                            5. +

                                            5. 物种概念中的单系和并系

                                            物种概念要求物种是单系的，但由于部分类群祖征的丢失，并系物种在自然界中很常见。
                                            研究表明，多达20%的动物物种和20%-50%的植物物种是并系的。

                                            +

                                            5.1. 一些例子

                                            并系群-排除的单系群-对应的完整单系群

                                            +
                                              +
                                            • 鱼fish-四足类Tetrapoda-脊椎动物Vertebrate
                                              • +
                                            • 爬行动物Reptiles-鸟类birds-蜥形目Sauropsida
                                              • +
                                            • 猴子Monkey-人猿总科Hominoidea-类人猿目Simiiformes
                                              • +
                                            +

                                            6. references

                                              +
                                            1. wiki:cladistics：https://en.wikipedia.org/wiki/Cladistics
                                              2. +
                                            2. wiki:monophyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Monophyly
                                              3. +
                                            3. wiki:paraphyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Paraphyly
                                              4. +
                                            4. wiki:polyphyly：https://en.wikipedia.org/wiki/Polyphyly
                                              5. +
                                            5. ArtemisiaLiu’s weibo：https://www.weibo.com/ttarticle/p/show?id=2309404308383288185230
                                              6. +
                                            6. http://wap.sciencenet.cn/blog-3454407-1262077.html?mobile=1
                                              @@ -8964,15 +8966,13 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 ]]> bio - evolution - ancestral state reconstruction + concept - bioinfo - biosoft - PAML - baseML - 祖先状态重建 + monophyly + paraphyly + polyphyly + cladistics @@ -9602,45 +9602,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 branch model - - 在Linux系统中设置环境变量PATH - /2021/04/20/linux_basics_PATH/ - - - - -

                                              1. 环境变量PATH设置

                                              1.1. PATH的解释

                                              PATH是环境变量，一个存放有（可执行）命令和程序的目录集合，目录间以冒号:分隔。

                                              -

                                              操作系统接到用户输入命令时，会从前到后依次查看PATH存储的目录，查找与输入命令同名的可执行文件，一旦查找到就停止查找，全部目录都查不到就报错。

                                              -

                                              echo $PATH可以查看当前存放了哪些目录。

                                              -

                                              1.2. 设置环境变量

                                              1.2.1. 临时设置，当前终端有效

                                                -
                                              1. 添加目录到环境变量
                                                PATH=$PATH:/home/usrname/opt/software/命令把目录/home/software/添加到PATH后，并用冒号:分隔，即重新给PATH赋值。
                                                2. -
                                              -

                                              PATH=$PATH:/home/software/和PATH=/home/software/:$PATH区别在于把目录/home/software/置于PATH的最前面还是最后面，最前面代表最优先使用这个目录下的命令。

                                              -
                                                -
                                              1. 声明环境变量
                                                export PATH命令声明变量，使其对系统shell可识别
                                                2. -
                                              -

                                              以上两条命令可以合并成export PATH=$PATH:/home/software/或者export PATH=/home/software/:$PATH，此时目录/home/software/下的命令可以被当前shell直接调用。

                                              -

                                              但这种设置方式只在当前shell有效，关掉shell就失效。

                                              -

                                              1.2.2. 当前用户永久设置

                                              登录服务器时，会自动运行当前用户下~/.bashrc和~/.bash_profile文件内的命令。

                                              -

                                              所以把export PATH=$PATH:/home/software/写入~/.bashrc或者~/.bash_profile文件就可以使目录/home/software/对于当前用户永久生效。

                                              -

                                              第一次写入后需要用命令source ~/.bashrc运行~/.bashrc文件来刷新环境变量，之后就不再需要。

                                              -

                                              1.2.3. 所有用户永久设置

                                              与前一步同理，不过写入的文件是/etc/profile或者/etc/bashrc，需要root用户修改。

                                              -

                                              第一次修改需要source /etc/profile刷新，之后不再需要。

                                              -
                                              -
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                                              • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                              • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                • -
                                              -]]>                                               - - linux - basics - - - linux - PATH - -                                               用PAML的codeML进行选择分析：（一）概况 /2023/10/10/evolution_selection_paml.codeml_intro/ @@ -10126,6 +10087,45 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 卡方检验(chi2 test) + + 在Linux系统中设置环境变量PATH + /2021/04/20/linux_basics_PATH/ + + + + +

                                              1. 环境变量PATH设置

                                              1.1. PATH的解释

                                              PATH是环境变量，一个存放有（可执行）命令和程序的目录集合，目录间以冒号:分隔。

                                              +

                                              操作系统接到用户输入命令时，会从前到后依次查看PATH存储的目录，查找与输入命令同名的可执行文件，一旦查找到就停止查找，全部目录都查不到就报错。

                                              +

                                              echo $PATH可以查看当前存放了哪些目录。

                                              +

                                              1.2. 设置环境变量

                                              1.2.1. 临时设置，当前终端有效

                                                +
                                              1. 添加目录到环境变量
                                                PATH=$PATH:/home/usrname/opt/software/命令把目录/home/software/添加到PATH后，并用冒号:分隔，即重新给PATH赋值。
                                                2. +
                                              +

                                              PATH=$PATH:/home/software/和PATH=/home/software/:$PATH区别在于把目录/home/software/置于PATH的最前面还是最后面，最前面代表最优先使用这个目录下的命令。

                                              +
                                                +
                                              1. 声明环境变量
                                                export PATH命令声明变量，使其对系统shell可识别
                                                2. +
                                              +

                                              以上两条命令可以合并成export PATH=$PATH:/home/software/或者export PATH=/home/software/:$PATH，此时目录/home/software/下的命令可以被当前shell直接调用。

                                              +

                                              但这种设置方式只在当前shell有效，关掉shell就失效。

                                              +

                                              1.2.2. 当前用户永久设置

                                              登录服务器时，会自动运行当前用户下~/.bashrc和~/.bash_profile文件内的命令。

                                              +

                                              所以把export PATH=$PATH:/home/software/写入~/.bashrc或者~/.bash_profile文件就可以使目录/home/software/对于当前用户永久生效。

                                              +

                                              第一次写入后需要用命令source ~/.bashrc运行~/.bashrc文件来刷新环境变量，之后就不再需要。

                                              +

                                              1.2.3. 所有用户永久设置

                                              与前一步同理，不过写入的文件是/etc/profile或者/etc/bashrc，需要root用户修改。

                                              +

                                              第一次修改需要source /etc/profile刷新，之后不再需要。

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                                              +
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                                              +]]>                                               + + linux + basics + + + linux + PATH + +                                               Linux中CPU相关概念 /2022/05/02/linux_basics_cpu/ @@ -10741,6 +10741,49 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 cache + + Linux系统服务器清理系统日志 + /2024/05/26/linux_operation.and.maintenance_log.release/ + + +

                                              1. 查看系统日志记录情况【需要root权限】

                                              服务器运行久了系统日志会满，有时开机会提示【SEL IS FULL】。这个时候就需要清理系统日志。
                                              系统日志存放在目录/var/log/journal/下面。

                                              +
                                                +
                                              1. ll /var/log/journal/查看系统日志文件
                                                2. +
                                              2. du -t 100M /var查看/var目录下面所有文件，包括系统日志和缓存等。
                                                3. +
                                              3. journalctl --disk-usage命令查看，得到Archived and active journals take up 1.9G in the file system.表示系统日志文件占了1.9G。
                                                4. +
                                              +

                                              2. 清理系统日志文件

                                                +
                                              1. journalctl命令会自动维护剩余日志文件，按文件大小或产生时间自动维护。【推荐】
                                                2. +
                                              +
                                                +
                                              • journalctl --vacuum-size=10M命令表示只保留最近时间10Mb的日志文件；
                                                • +
                                              • journalctl --vacuum-time=1w命令表示只保留最近一周的日志文件。
                                                • +
                                              +
                                                +
                                              1. 也可以单独一次清理
                                                2. +
                                              +
                                                +
                                              • rm -rf /var/log/journal/*命令直接删除/var/log/journal/目录下的所有文件
                                                • +
                                              +
                                                +
                                              1. 清理完之后再使用journalctl --disk-usage命令查看，会发现日志文件容量变小。
                                                2. +
                                              +
                                              +
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                                                • +
                                              +]]>                                               + + linux + operation and maintenance + log + + + server + log + +                                               Linux系统服务器用户账号的管理 /2024/01/09/linux_operation.and.maintenance_user.account/ @@ -10908,80 +10951,29 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有

                                              4.2. 删除用户组 —— groupdel

                                              删除已有用户组的命令很简单：groupdel group1命令即删除用户组group1了

                                              4.3. 修改用户组属性 —— groupmod

                                              1. 语法：groupmod 选项 用户组
                                                2. -
                                              2. 选项参数
                                                3. -
                                              -
                                                -
                                              • -g GID：为用户组指定新的组标识号（GID）。
                                                • -
                                              • -o：一般与-g选项同时使用，表示用户组的新GID可以与系统已有用户组的GID相同。
                                                • -
                                              • -n 新用户组：将用户组的名字修改为新名字。
                                                • -
                                              -
                                                -
                                              1. 实例
                                                2. -
                                              -
                                                -
                                              • groupmod -g 102 group2：此命令将组group2的组标识号修改为102。
                                                • -
                                              • groupmod –g 10000 -n group3 group2：此命令将组group2的标识号改为10000，组名修改为group3。
                                                • -
                                              -

                                              4.4. 切换用户组 —— newgrp

                                              如果一个用户同时属于多个用户组，那么用户可以在用户组之间切换，以便具有其他用户组的权限。

                                              -
                                                -
                                              1. 用户可以在登录后，使用命令newgrp切换到其他用户组，这个命令的参数就是目的用户组。
                                                2. -
                                              2. 实例：newgrp root
                                                3. -
                                              3. 这条命令将当前用户切换到root用户组，前提条件是root用户组确实是该用户的主组或附加组。
                                                4. -
                                              -

                                              5. 用户账号管理的集成工具

                                              Linux提供了集成的系统管理工具userconf，它可以用来对用户账号和用户组进行统一管理。

                                              -

                                              6. reference

                                                -
                                              1. https://www.runoob.com/linux/linux-user-manage.html
                                                2. -
                                              -
                                              -
                                                -
                                              • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                              • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                • -
                                              -]]> - - linux - operation and maintenance - user - - - server - user - useradd - usermod - userdel - passwd - groupadd - groupmod - groupdel - newgrp - -                                               - - Linux系统服务器清理系统日志 - /2024/05/26/linux_operation.and.maintenance_log.release/ - - -

                                              1. 查看系统日志记录情况【需要root权限】

                                              服务器运行久了系统日志会满，有时开机会提示【SEL IS FULL】。这个时候就需要清理系统日志。
                                              系统日志存放在目录/var/log/journal/下面。

                                              -
                                                -
                                              1. ll /var/log/journal/查看系统日志文件
                                                2. -
                                              2. du -t 100M /var查看/var目录下面所有文件，包括系统日志和缓存等。
                                                3. -
                                              3. journalctl --disk-usage命令查看，得到Archived and active journals take up 1.9G in the file system.表示系统日志文件占了1.9G。
                                                4. -
                                              -

                                              2. 清理系统日志文件

                                                -
                                              1. journalctl命令会自动维护剩余日志文件，按文件大小或产生时间自动维护。【推荐】
                                                2. +
                                              2. 选项参数
                                                -
                                              • journalctl --vacuum-size=10M命令表示只保留最近时间10Mb的日志文件；
                                                • -
                                              • journalctl --vacuum-time=1w命令表示只保留最近一周的日志文件。
                                                • +
                                              • -g GID：为用户组指定新的组标识号（GID）。
                                                • +
                                              • -o：一般与-g选项同时使用，表示用户组的新GID可以与系统已有用户组的GID相同。
                                                • +
                                              • -n 新用户组：将用户组的名字修改为新名字。
                                              -
                                                -
                                              1. 也可以单独一次清理
                                                2. +
                                                  +
                                                1. 实例
                                                  -
                                                • rm -rf /var/log/journal/*命令直接删除/var/log/journal/目录下的所有文件
                                                  • +
                                                • groupmod -g 102 group2：此命令将组group2的组标识号修改为102。
                                                  • +
                                                • groupmod –g 10000 -n group3 group2：此命令将组group2的标识号改为10000，组名修改为group3。
                                                -
                                                  -
                                                1. 清理完之后再使用journalctl --disk-usage命令查看，会发现日志文件容量变小。
                                                  2. +

                                                  4.4. 切换用户组 —— newgrp

                                                  如果一个用户同时属于多个用户组，那么用户可以在用户组之间切换，以便具有其他用户组的权限。

                                                  +
                                                    +
                                                  1. 用户可以在登录后，使用命令newgrp切换到其他用户组，这个命令的参数就是目的用户组。
                                                    2. +
                                                  2. 实例：newgrp root
                                                    3. +
                                                  3. 这条命令将当前用户切换到root用户组，前提条件是root用户组确实是该用户的主组或附加组。
                                                    4. +
                                                  +

                                                  5. 用户账号管理的集成工具

                                                  Linux提供了集成的系统管理工具userconf，它可以用来对用户账号和用户组进行统一管理。

                                                  +

                                                  6. reference

                                                    +
                                                  1. https://www.runoob.com/linux/linux-user-manage.html
                                                    @@ -10992,11 +10984,19 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 linux operation and maintenance - log + user server - log + user + useradd + usermod + userdel + passwd + groupadd + groupmod + groupdel + newgrp @@ -11945,133 +11945,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 GFAP - - 基因组注释（四）：非编码RNA的注释-用Infernal软件对Rfam 12进行RNA注释 - /2022/04/22/omics_genome.annotation_ncRNA/ - - -

                                                    1. ncRNA

                                                    非编码RNA(Non-coding RNA, ncRNA) 包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等不编码蛋白质的RNA，它们转录后直接在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能，并不需要翻译成蛋白质。

                                                    -

                                                    2. 注释软件

                                                      -
                                                    • 非编码RNA种类繁多，且结构特征各不相同，所以开发出了许多注释特定某一类RNA的软件，比如tRNAScan-SE预测tRNA，rnammer预测rRNA，snoScan 搜索带C/D盒的snoRNAs，SnoGps 搜索带H/ACA盒的snoRNAs，mirScan搜索microRNA等。
                                                      • -
                                                    • Sanger实验室开发了Infernal软件，建立了1600多个RNA家族，并对每个家族建立了一致性二级结构和协方差模型，形成了Rfam数据库。采用Rfam数据库中的每个RNA的协方差模型，结合Infernal软件可以预测出已有RNA家族的新成员，只是特异性比较差。
                                                      • -
                                                    -

                                                    如果不是专门研究ncRNA，可以用Infernal注释所有ncRNA。如果需要更精细的注释，则可以选择特定软件注释特定RNA。

                                                    -

                                                    这篇博客是介绍用Infernal程序与Rfam数据库一起用来注释与数据库中已知ncRNA同源的序列（这里用来注释完整的基因组）。注释结果包括tRNA，rRNA，snRNA，snoRNA和miRNA等。

                                                    -

                                                    3. Infernal

                                                    Infernal全称是”INFERence of RNA ALignment”，是一个用来检索DNA序列数据库中RNA序列和结构相似性的软件，通过协方差模型covariance models (CMs)来实现。

                                                    -

                                                    3.1. 安装Infernal

                                                    conda install -c bioconda infernal
                                                    现在安装的是v1.1.4

                                                    -

                                                    安装后可使用的命令包括：

                                                    -
                                                      -
                                                    • cmpress：对cm文件进行压缩并建立索引。
                                                      • -
                                                    • cmscan：用提交的序列在cm数据库中进行检索。
                                                      • -
                                                    • cmalign：将RNA序列同协方差模型进行比对，并输出为stockholm格式。
                                                      • -
                                                    • cmbuild：通过多序列比对结果建立一个协方差模型，并保存在新文件中。
                                                      • -
                                                    • cmcalibrate：对协方差模型(CM)进行校准，在使用cmsearch和cmscan前CM模型需要先经过这个程序的处理。
                                                      • -
                                                    • cmconvert：用于格式转换，是将infernal 1.0以后的CM转化为当前版本需要的CM。但对1.0之前的版本无效。
                                                      • -
                                                    • cmemit：一个采样程序，从CM中进行采样并输出。
                                                      • -
                                                    • cmfetch：从一个大的CM文件中获取一个或多个CM。
                                                      • -
                                                    • cmsearch：用提交的CM模型在序列数据库中进行检索。
                                                      • -
                                                    • cmstat：对CM文件中的CM模型进行统计汇总。
                                                      • -
                                                    -

                                                    4. Rfam

                                                    Rfam是RNA family数据库，包括ncRNA序列和ncRNA的二级结构，每个family用多序列比对和协方差模型covariance model (CM)来表示。

                                                    -
                                                      -
                                                    1. 下载Rfam数据库
                                                      2. -
                                                    -
                                                      -
                                                    • wget http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Rfam/CURRENT/Rfam.cm.gz
                                                      在Rfam网站下载Rfam最新版本的CM数据库（目前是Rfam 14.7）
                                                      • -
                                                    • gunzip Rfam.cm.gz
                                                      解压数据库
                                                      • -
                                                    -
                                                      -
                                                    1. 下载clanin
                                                      2. -
                                                    -
                                                      -
                                                    • wget http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Rfam/CURRENT/Rfam.clanin
                                                      在Rfam网站下载Rfam数据库配套的clanin文件。
                                                      • -
                                                    -

                                                    5. 注释ncRNA

                                                    5.1. 建库

                                                      -
                                                    • cmpress Rfam.cm
                                                      使用cmpress压缩并建立索引，生成Rfam.cm.i1f, Rfam.cm.i1i, Rfam.cm.i1m, Rfam.cm.i1p。
                                                      • -
                                                    -

                                                    5.2. 注释

                                                      -
                                                    1. 序列索引
                                                      推荐的参数：
                                                      2. -
                                                    -

                                                    nohup cmscan -Z 512 --cut_ga --rfam --nohmmonly --fmt 2 --tblout sample.tblout -o sample.result --clanin Rfam.clanin Rfam.cm genome.fa &

                                                    -
                                                      -
                                                    • -Z：根据基因组大小来定，基因组大小的2倍，Mb单位，选一个整数。比如256Mb的基因组，-Z 512。
                                                      • -
                                                    • --cut_ga --rfam --nohmmonly --fmt 2：推荐使用
                                                      • -
                                                    • –tblout sample.tblout：指定table格式输出文件
                                                      • -
                                                    • -o sample.result：指定比对结果输出文件
                                                      • -
                                                    • –clanin Rfam.clanin：指定clanin文件
                                                      • -
                                                    • Rfam.cm genome.fa：指定数据库Rfam.cm和基因组genome.fa
                                                      • -
                                                    -

                                                    note：-o sample.result要放在Rfam.cm genome.fa前面，否则报错。

                                                    -

                                                    此步骤耗时参考：250Mb基因组，默认线程，耗时2.5h。

                                                    -
                                                      -
                                                    1. 结果文件
                                                      2. -
                                                    -
                                                      -
                                                    • sample.result：比对结果
                                                      • -
                                                    • sample.tblout：table格式结果
                                                      • -
                                                    -

                                                    5.3. 整理结果

                                                    5.3.1. 将注释结果整理成gff3文件

                                                    gff3文件可用于提交注释到数据库。

                                                    -

                                                    用perl脚本infernal-tblout2gff.pl实现，脚本来自https://www.cnblogs.com/jessepeng/p/15392809.html。

                                                    -

                                                    perl infernal-tblout2gff.pl --cmscan --fmt2 sample.tblout >sample.infernal.ncRNA.gff3

                                                    -

                                                    5.3.2. 统计各类ncRNA总数

                                                      -

                                                    1. 整理注释结果文件sample.tblout
                                                      提取必需的列，非重叠区域或重叠区域得分高的区域
                                                      awk 'BEGIN{OFS="\t";}{if(FNR==1) print "target_name\taccession\tquery_name\tquery_start\tquery_end\tstrand\tscore\tEvalue"; if(FNR>2 && $20!="=" && $0!~/^#/) print $2,$3,$4,$10,$11,$12,$17,$18; }' sample.tblout >sample.tblout.xls

                                                      -
                                                      2. -

                                                    2. 下载rfam注释

                                                      -
                                                      3. -
                                                    -
                                                      -
                                                    • 在rfam官网，选择【SEARCH】-【Entry type】
                                                      • -
                                                    • 然后选中所有的Entry types（包括Gene，Intron，Cis-regulatory element），点击【Submit】，会列出所有RNA family的注释信息。
                                                      • -
                                                    • 手动选择所有注释信息，复制，粘贴到新建的空白文本文件rfam.txt并保存。
                                                      • -
                                                    • 把rfam.txt传输到服务器，最好用dos2unix rfam.txt转换文件格式为unix版本。
                                                      • -
                                                    • 拆分第三列cat rfam.txt | awk 'BEGIN {FS=OFS="\t"}{split($3,x,";");class=x[2];print $1,$2,$3,$4,class}' > rfam_anno.txt
                                                      • -
                                                    -

                                                    rfam注释文件rfam_anno.txt包含了所有rfam的类型type和功能描述description信息。

                                                    -
                                                      -
                                                    1. 统计ncRNA注释结果
                                                      awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}ARGIND==1{a[$2]=$5;}ARGIND==2{type=a[$1]; if(type=="") type="Others"; count[type]+=1;}END{for(type in count) print type, count[type];}' rfam_anno.txt sample.tblout.xls >sample.ncRNA.statistic
                                                      2. -
                                                    -

                                                    sample.ncRNA.statistic输出示例：

                                                    -
                                                     riboswitch	1
                                                     ribozyme	1
                                                     tRNA	699
                                                    Others	41
                                                     miRNA	188
                                                     antisense	4
                                                     rRNA	233
                                                     snRNA	698
                                                    - -
                                                      -
                                                    1. 统计细分分类
                                                      2. -
                                                    -
                                                      -
                                                    • 也可以根据细分分类分别统计，细分分类参考rfam官网，【SEARCH】-【Entry type】。
                                                      • -
                                                    • 可参考的统计值包括每个细分ncRNA的数量(copy)，平均长度(average length)，总长(total length)，总长占基因组的比例（Percent of the genome）等
                                                      • -
                                                    • 统计后整理成发表文章用的表格。
                                                      • -
                                                    -

                                                    比如：snRNA包括snoRNA和splicing，snoRNA包括CD-box，HACA-box和scaRNA。下面用统计CD-box这个细分分类的ncRNA举例。

                                                    -
                                                      -
                                                    • 提取CD-box的Accession(RF00000格式)：grep "CD-box" rfam_anno.txt |cut -f1 >cdbox.tem
                                                      • -
                                                    • 提取注释到的CD-box信息：grep -f cdbox.tem mc.tblout.xls >cdbox.txt
                                                      • -
                                                    • cdbox.txt的行数就是CD-box的数量；利用第四五列的位置信息，即可统计平均长度(average length)，总长(total length)，注意正反链。
                                                      • -
                                                    -

                                                    6. references

                                                      -
                                                    1. https://www.cnblogs.com/jessepeng/p/15392809.html
                                                      2. -
                                                    2. http://www.360doc.com/content/18/1119/05/52645714_795799901.shtml
                                                      3. -
                                                    3. https://genehub.wordpress.com/2019/08/08/%E6%A4%8D%E7%89%A9%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%BB%84ncrna%E9%A2%84%E6%B5%8B%EF%BC%88trna%E3%80%81rrna%E3%80%81snrna%E3%80%81mirna%EF%BC%89/
                                                      4. -
                                                    4. http://embracethesky.cn/2018/07/08/%e4%bd%bf%e7%94%a8infernal%e5%af%b9rfam-12%e8%bf%9b%e8%a1%8crna%e6%b3%a8%e9%87%8a/#more-99
                                                      5. -
                                                    -
                                                    -
                                                      -
                                                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                      • -
                                                    • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                      • -
                                                    -]]>                                                     - - omics - genome - annotation - - - genome - genome annotation - ncRNA - Infernal - Rfam - -                                                     基因组注释（一）：重复序列注释 /2021/08/02/omics_genome.annotation_repeat/ @@ -12393,30 +12266,160 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                    1. 用RepeatMasker根据已有TE库进行注释
                                                    -

                                                    RepeatMasker -pa 36 -q -no_is -norna -nolow -div 40 -lib sample.TE.lib.fasta -cutoff 225 sample.fa

                                                    +

                                                    RepeatMasker -pa 36 -q -no_is -norna -nolow -div 40 -lib sample.TE.lib.fasta -cutoff 225 sample.fa

                                                    +
                                                      +
                                                    1. 用lib-test.pl进行TE注释的比较和评估
                                                      2. +
                                                    +
                                                    perl lib-test.pl -genome genome.fasta -std genome.stdlib.RM.out -tst genome.testlib.RM.out -cat [options]
                                                    	-genome	[file]	FASTA format genomesequence
                                                    	-std	[file]	RepeatMasker .out file of the standard library
                                                    	-tst	[file]	RepeatMasker .out file of the test library
                                                    	-cat	[string]	Testing TE category. Use one of LTR|nonLTR|LINE|SINE|TIR|MITEHelitron|Total|Classified
                                                    	-N	[0|1]	Include Ns in total length of the genome. Defaule: 0 (not include Ns).
                                                    	-unknown	[0|1]	Include unknownannotations to the testing category. This should be used when
                                                    				the test library has no classification and you assume they all belong to the
                                                    				target category specified by -cat. 	Default: 0 (not include unknowns)
                                                    	-rand	[int]	A randum number used to identify the current run. (default:generate automatically)
                                                    	-threads|-t	[int]	Number of threads torun this program. Default: 4
                                                    + +

                                                    lib-test.pl -genome sample.fa -std genome.stdlib.RM.out -tst genome.testlib.RM.out -cat LTR

                                                    +

                                                    3.6. notes

                                                      +
                                                    • 基因组的碱基全部大写，因为小写在一些软件是被认为进行了soft-masked的，在TIR预测时会报错。
                                                      • +
                                                    • -t设置线程，当运行到调用RMBlast引擎时，默认使用四核，如果服务器是四核，则实际使用线程为设置的-t的四倍（RepeatMasker和RepeatModeler的-pa设置线程有一样的问题），EDTA支持断点续跑，可以先设置-t 高一点，运行到RMBlast时，kill掉，重新设置低一点的-t。
                                                      • +
                                                    • 预测有时运行会报错缺一些perl的module，例如Bio，安装缺失的module，再次运行即可。
                                                      • +
                                                    • 关于–rmout，当使用这个参数指定同源TE注释时，不使用EDTA的同源注释，而是用这个参数指定的库做同源注释，最终结果是这个同源注释加上EDTA其他注释的完整的intact TEs结果。所以当提供的repeatmasker文件预测结果非常全面时，使用这个参数；如果提供的库对物种TE的预测结果不够全面，使用这个参数反而会降低最终预测结果，不建议使用这个参数。不知道是否提供的库是否全面，有时间就有这个参数和没这个参数的结果比较选用，没时间就直接不用这个参数。参考issue。
                                                      • +
                                                    • HelitronScanner预测Helitrons默认需要400G运行内存，若不够会出现如下报错，把运行内存上限升高后再次运行即可：
                                                      • +
                                                    +
                                                    ERROR: Raw Helitron results not found in sample.fa.mod.EDTA.raw/sample.fa.mod.Helitron.raw.fa
                                                    	If you believe the program is working properly, this may be caused by the lack of intact Helitrons in your genome. Consider to use the --force 1 parameter to overwrite this check
                                                    + +

                                                    references

                                                      +
                                                    1. https://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_repeat
                                                      2. +
                                                    2. https://en.wikipedia.org/wiki/Microsatellite
                                                      3. +
                                                    3. http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler/
                                                      4. +
                                                    4. https://www.cnblogs.com/zhanmaomao/p/12345462.html
                                                      5. +
                                                    5. https://www.jianshu.com/p/ddd1c9a74fde
                                                      6. +
                                                    6. https://www.jianshu.com/p/dfa89f394882
                                                      7. +
                                                    7. https://wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/Repeat_types.html
                                                      8. +
                                                    +
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                                                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                                      • +
                                                    +]]> + + omics + genome + annotation + + + genome + genome annotation + repeat sequences + transposable elements(TE) + RepeatMasker + RepeatModeler + EDTA + tandem repeat + +                                                     + + 基因组注释（四）：非编码RNA的注释-用Infernal软件对Rfam 12进行RNA注释 + /2022/04/22/omics_genome.annotation_ncRNA/ + + +

                                                    1. ncRNA

                                                    非编码RNA(Non-coding RNA, ncRNA) 包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等不编码蛋白质的RNA，它们转录后直接在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能，并不需要翻译成蛋白质。

                                                    +

                                                    2. 注释软件

                                                      +
                                                    • 非编码RNA种类繁多，且结构特征各不相同，所以开发出了许多注释特定某一类RNA的软件，比如tRNAScan-SE预测tRNA，rnammer预测rRNA，snoScan 搜索带C/D盒的snoRNAs，SnoGps 搜索带H/ACA盒的snoRNAs，mirScan搜索microRNA等。
                                                      • +
                                                    • Sanger实验室开发了Infernal软件，建立了1600多个RNA家族，并对每个家族建立了一致性二级结构和协方差模型，形成了Rfam数据库。采用Rfam数据库中的每个RNA的协方差模型，结合Infernal软件可以预测出已有RNA家族的新成员，只是特异性比较差。
                                                      • +
                                                    +

                                                    如果不是专门研究ncRNA，可以用Infernal注释所有ncRNA。如果需要更精细的注释，则可以选择特定软件注释特定RNA。

                                                    +

                                                    这篇博客是介绍用Infernal程序与Rfam数据库一起用来注释与数据库中已知ncRNA同源的序列（这里用来注释完整的基因组）。注释结果包括tRNA，rRNA，snRNA，snoRNA和miRNA等。

                                                    +

                                                    3. Infernal

                                                    Infernal全称是”INFERence of RNA ALignment”，是一个用来检索DNA序列数据库中RNA序列和结构相似性的软件，通过协方差模型covariance models (CMs)来实现。

                                                    +

                                                    3.1. 安装Infernal

                                                    conda install -c bioconda infernal
                                                    现在安装的是v1.1.4

                                                    +

                                                    安装后可使用的命令包括：

                                                    +
                                                      +
                                                    • cmpress：对cm文件进行压缩并建立索引。
                                                      • +
                                                    • cmscan：用提交的序列在cm数据库中进行检索。
                                                      • +
                                                    • cmalign：将RNA序列同协方差模型进行比对，并输出为stockholm格式。
                                                      • +
                                                    • cmbuild：通过多序列比对结果建立一个协方差模型，并保存在新文件中。
                                                      • +
                                                    • cmcalibrate：对协方差模型(CM)进行校准，在使用cmsearch和cmscan前CM模型需要先经过这个程序的处理。
                                                      • +
                                                    • cmconvert：用于格式转换，是将infernal 1.0以后的CM转化为当前版本需要的CM。但对1.0之前的版本无效。
                                                      • +
                                                    • cmemit：一个采样程序，从CM中进行采样并输出。
                                                      • +
                                                    • cmfetch：从一个大的CM文件中获取一个或多个CM。
                                                      • +
                                                    • cmsearch：用提交的CM模型在序列数据库中进行检索。
                                                      • +
                                                    • cmstat：对CM文件中的CM模型进行统计汇总。
                                                      • +
                                                    +

                                                    4. Rfam

                                                    Rfam是RNA family数据库，包括ncRNA序列和ncRNA的二级结构，每个family用多序列比对和协方差模型covariance model (CM)来表示。

                                                    +
                                                      +
                                                    1. 下载Rfam数据库
                                                      2. +
                                                    +
                                                      +
                                                    • wget http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Rfam/CURRENT/Rfam.cm.gz
                                                      在Rfam网站下载Rfam最新版本的CM数据库（目前是Rfam 14.7）
                                                      • +
                                                    • gunzip Rfam.cm.gz
                                                      解压数据库
                                                      • +
                                                    +
                                                      +
                                                    1. 下载clanin
                                                      2. +
                                                    +
                                                      +
                                                    • wget http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Rfam/CURRENT/Rfam.clanin
                                                      在Rfam网站下载Rfam数据库配套的clanin文件。
                                                      • +
                                                    +

                                                    5. 注释ncRNA

                                                    5.1. 建库

                                                      +
                                                    • cmpress Rfam.cm
                                                      使用cmpress压缩并建立索引，生成Rfam.cm.i1f, Rfam.cm.i1i, Rfam.cm.i1m, Rfam.cm.i1p。
                                                      • +
                                                    +

                                                    5.2. 注释

                                                      +
                                                    1. 序列索引
                                                      推荐的参数：
                                                      2. +
                                                    +

                                                    nohup cmscan -Z 512 --cut_ga --rfam --nohmmonly --fmt 2 --tblout sample.tblout -o sample.result --clanin Rfam.clanin Rfam.cm genome.fa &

                                                    +
                                                      +
                                                    • -Z：根据基因组大小来定，基因组大小的2倍，Mb单位，选一个整数。比如256Mb的基因组，-Z 512。
                                                      • +
                                                    • --cut_ga --rfam --nohmmonly --fmt 2：推荐使用
                                                      • +
                                                    • –tblout sample.tblout：指定table格式输出文件
                                                      • +
                                                    • -o sample.result：指定比对结果输出文件
                                                      • +
                                                    • –clanin Rfam.clanin：指定clanin文件
                                                      • +
                                                    • Rfam.cm genome.fa：指定数据库Rfam.cm和基因组genome.fa
                                                      • +
                                                    +

                                                    note：-o sample.result要放在Rfam.cm genome.fa前面，否则报错。

                                                    +

                                                    此步骤耗时参考：250Mb基因组，默认线程，耗时2.5h。

                                                      -
                                                    1. 用lib-test.pl进行TE注释的比较和评估
                                                      2. +
                                                    2. 结果文件
                                                    -
                                                    perl lib-test.pl -genome genome.fasta -std genome.stdlib.RM.out -tst genome.testlib.RM.out -cat [options]
                                                    	-genome	[file]	FASTA format genomesequence
                                                    	-std	[file]	RepeatMasker .out file of the standard library
                                                    	-tst	[file]	RepeatMasker .out file of the test library
                                                    	-cat	[string]	Testing TE category. Use one of LTR|nonLTR|LINE|SINE|TIR|MITEHelitron|Total|Classified
                                                    	-N	[0|1]	Include Ns in total length of the genome. Defaule: 0 (not include Ns).
                                                    	-unknown	[0|1]	Include unknownannotations to the testing category. This should be used when
                                                    				the test library has no classification and you assume they all belong to the
                                                    				target category specified by -cat. 	Default: 0 (not include unknowns)
                                                    	-rand	[int]	A randum number used to identify the current run. (default:generate automatically)
                                                    	-threads|-t	[int]	Number of threads torun this program. Default: 4
                                                    - -

                                                    lib-test.pl -genome sample.fa -std genome.stdlib.RM.out -tst genome.testlib.RM.out -cat LTR

                                                    -

                                                    3.6. notes

                                                      -
                                                    • 基因组的碱基全部大写，因为小写在一些软件是被认为进行了soft-masked的，在TIR预测时会报错。
                                                      • -
                                                    • -t设置线程，当运行到调用RMBlast引擎时，默认使用四核，如果服务器是四核，则实际使用线程为设置的-t的四倍（RepeatMasker和RepeatModeler的-pa设置线程有一样的问题），EDTA支持断点续跑，可以先设置-t 高一点，运行到RMBlast时，kill掉，重新设置低一点的-t。
                                                      • -
                                                    • 预测有时运行会报错缺一些perl的module，例如Bio，安装缺失的module，再次运行即可。
                                                      • -
                                                    • 关于–rmout，当使用这个参数指定同源TE注释时，不使用EDTA的同源注释，而是用这个参数指定的库做同源注释，最终结果是这个同源注释加上EDTA其他注释的完整的intact TEs结果。所以当提供的repeatmasker文件预测结果非常全面时，使用这个参数；如果提供的库对物种TE的预测结果不够全面，使用这个参数反而会降低最终预测结果，不建议使用这个参数。不知道是否提供的库是否全面，有时间就有这个参数和没这个参数的结果比较选用，没时间就直接不用这个参数。参考issue。
                                                      • -
                                                    • HelitronScanner预测Helitrons默认需要400G运行内存，若不够会出现如下报错，把运行内存上限升高后再次运行即可：
                                                      • +
                                                        +
                                                      • sample.result：比对结果
                                                        • +
                                                      • sample.tblout：table格式结果
                                                      -
                                                      ERROR: Raw Helitron results not found in sample.fa.mod.EDTA.raw/sample.fa.mod.Helitron.raw.fa
                                                      	If you believe the program is working properly, this may be caused by the lack of intact Helitrons in your genome. Consider to use the --force 1 parameter to overwrite this check
                                                      +

                                                      5.3. 整理结果

                                                      5.3.1. 将注释结果整理成gff3文件

                                                      gff3文件可用于提交注释到数据库。

                                                      +

                                                      用perl脚本infernal-tblout2gff.pl实现，脚本来自https://www.cnblogs.com/jessepeng/p/15392809.html。

                                                      +

                                                      perl infernal-tblout2gff.pl --cmscan --fmt2 sample.tblout >sample.infernal.ncRNA.gff3

                                                      +

                                                      5.3.2. 统计各类ncRNA总数

                                                        +

                                                      1. 整理注释结果文件sample.tblout
                                                        提取必需的列，非重叠区域或重叠区域得分高的区域
                                                        awk 'BEGIN{OFS="\t";}{if(FNR==1) print "target_name\taccession\tquery_name\tquery_start\tquery_end\tstrand\tscore\tEvalue"; if(FNR>2 && $20!="=" && $0!~/^#/) print $2,$3,$4,$10,$11,$12,$17,$18; }' sample.tblout >sample.tblout.xls

                                                        +
                                                        2. +

                                                      2. 下载rfam注释

                                                        +
                                                        3. +
                                                      +
                                                        +
                                                      • 在rfam官网，选择【SEARCH】-【Entry type】
                                                        • +
                                                      • 然后选中所有的Entry types（包括Gene，Intron，Cis-regulatory element），点击【Submit】，会列出所有RNA family的注释信息。
                                                        • +
                                                      • 手动选择所有注释信息，复制，粘贴到新建的空白文本文件rfam.txt并保存。
                                                        • +
                                                      • 把rfam.txt传输到服务器，最好用dos2unix rfam.txt转换文件格式为unix版本。
                                                        • +
                                                      • 拆分第三列cat rfam.txt | awk 'BEGIN {FS=OFS="\t"}{split($3,x,";");class=x[2];print $1,$2,$3,$4,class}' > rfam_anno.txt
                                                        • +
                                                      +

                                                      rfam注释文件rfam_anno.txt包含了所有rfam的类型type和功能描述description信息。

                                                      +
                                                        +
                                                      1. 统计ncRNA注释结果
                                                        awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}ARGIND==1{a[$2]=$5;}ARGIND==2{type=a[$1]; if(type=="") type="Others"; count[type]+=1;}END{for(type in count) print type, count[type];}' rfam_anno.txt sample.tblout.xls >sample.ncRNA.statistic
                                                        2. +
                                                      +

                                                      sample.ncRNA.statistic输出示例：

                                                      +
                                                       riboswitch	1
                                                       ribozyme	1
                                                       tRNA	699
                                                      Others	41
                                                       miRNA	188
                                                       antisense	4
                                                       rRNA	233
                                                       snRNA	698
                                                      -

                                                      references

                                                        -
                                                      1. https://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_repeat
                                                        2. -
                                                      2. https://en.wikipedia.org/wiki/Microsatellite
                                                        3. -
                                                      3. http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler/
                                                        4. -
                                                      4. https://www.cnblogs.com/zhanmaomao/p/12345462.html
                                                        5. -
                                                      5. https://www.jianshu.com/p/ddd1c9a74fde
                                                        6. -
                                                      6. https://www.jianshu.com/p/dfa89f394882
                                                        7. -
                                                      7. https://wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/Repeat_types.html
                                                        8. +
                                                          +
                                                        1. 统计细分分类
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 也可以根据细分分类分别统计，细分分类参考rfam官网，【SEARCH】-【Entry type】。
                                                          • +
                                                        • 可参考的统计值包括每个细分ncRNA的数量(copy)，平均长度(average length)，总长(total length)，总长占基因组的比例（Percent of the genome）等
                                                          • +
                                                        • 统计后整理成发表文章用的表格。
                                                          • +
                                                        +

                                                        比如：snRNA包括snoRNA和splicing，snoRNA包括CD-box，HACA-box和scaRNA。下面用统计CD-box这个细分分类的ncRNA举例。

                                                        +
                                                          +
                                                        • 提取CD-box的Accession(RF00000格式)：grep "CD-box" rfam_anno.txt |cut -f1 >cdbox.tem
                                                          • +
                                                        • 提取注释到的CD-box信息：grep -f cdbox.tem mc.tblout.xls >cdbox.txt
                                                          • +
                                                        • cdbox.txt的行数就是CD-box的数量；利用第四五列的位置信息，即可统计平均长度(average length)，总长(total length)，注意正反链。
                                                          • +
                                                        +

                                                        6. references

                                                          +
                                                        1. https://www.cnblogs.com/jessepeng/p/15392809.html
                                                          2. +
                                                        2. http://www.360doc.com/content/18/1119/05/52645714_795799901.shtml
                                                          3. +
                                                        3. https://genehub.wordpress.com/2019/08/08/%E6%A4%8D%E7%89%A9%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%BB%84ncrna%E9%A2%84%E6%B5%8B%EF%BC%88trna%E3%80%81rrna%E3%80%81snrna%E3%80%81mirna%EF%BC%89/
                                                          4. +
                                                        4. http://embracethesky.cn/2018/07/08/%e4%bd%bf%e7%94%a8infernal%e5%af%b9rfam-12%e8%bf%9b%e8%a1%8crna%e6%b3%a8%e9%87%8a/#more-99
                                                          @@ -12432,12 +12435,9 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome genome annotation - repeat sequences - transposable elements(TE) - RepeatMasker - RepeatModeler - EDTA - tandem repeat + ncRNA + Infernal + Rfam @@ -12528,11 +12528,11 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                      Outline of the hifiasm algorithm -

                                                      Figure 1. Hifiasm算法概况 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

                                                      +

                                                      Figure 1. Hifiasm算法概况 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

                                                      1.1. 校正测序错误

                                                      1. 尽管Hifi reads使用CCS测序模式已经进行了一轮校正，准确性已经比CLR测序模式高很多，但仍然会有部分测序(<1%)错误。
                                                      2. Hifiasm进行所有序列的相互比对(all-versus-all)来校正可能的测序错误。
                                                        3. -
                                                      3. 在比对中基于reads间的overlap关系来校正错误。如果在比对的同一个位置出现两种碱基类型（不考虑gaps），且每个碱基类型至少有3条reads支持，那么这个位置会被当作杂合位点（SNP）被保留。在这一步，Hifiasm可以对杂合SNP进行定相（phasing）。
                                                        4. +
                                                      4. 在比对中基于reads间的overlap关系来校正错误。如果在比对的同一个位置出现两种碱基类型（不考虑gaps），且每个碱基类型至少有3条reads支持，那么这个位置会被当作杂合位点（SNP）被保留。在这一步，Hifiasm可以对杂合SNP进行定相/分型（phasing）。
                                                      5. 如果达不到上述条件的两碱基比对，两种碱基中较少的一种被视作测序错误，将被校正（默认三轮校正）。值得注意的是，Hifiasm只使用相同单倍型的数据进行纠错，从而避免过度校正，保留来自不同单倍型的杂合变异信息。

                                                      1.2. 构建分型字符串图（phased string graph）

                                                        @@ -12554,7 +12554,7 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                      Outline of trio binning and haplotype assembly -

                                                      Figure 2. TrioCanu软件的trio-binning策略 图片来源：https://www.nature.com/articles/nbt.4277

                                                      +

                                                      Figure 2. TrioCanu软件的trio-binning策略 图片来源：https://www.nature.com/articles/nbt.4277

                                                      2.2. Hifiasm的trio-binning模式

                                                      1. 与TrioCanu软件的trio-binning策略不同，Hifiasm使用了graph-binning的策略对此进行了改进。
                                                      @@ -12580,11 +12580,11 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                    Effect of false read binning -

                                                    Figure 3. 错误的reads分型在Hifiasm的trio-binning模式中会被修正 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

                                                    +

                                                    Figure 3. 错误的reads分型在Hifiasm的trio-binning模式中会被修正 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5

                                                    3. 新算法Hifiasm(Hi-C)：Hi-C Integrated assembly 模式

                                                    李恒团队2022年在Nature biotechnology上发表论文Haplotype-resolved assembly of diploid genomes without parental data（https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x），在Hifiasm中引入了新算法Hifiasm(Hi-C)，可以使用Hi-C Integrated assembly 模式进行单倍体分型组装。

                                                    3.1. Hi-C Integrated assembly模式

                                                    1. Hi-C Integrated assembly模式针对PacBio HiFi (High-Fidelity) 长读长测序技术和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 测序技术进行了全新的设计。
                                                      2. -
                                                    2. 在无亲本数据的情况下，利用30倍覆盖度的HiFi数据和30倍覆盖度的Hi-C数据也可以获得二倍体生物的单倍型解决的组装结果。
                                                      3. +
                                                    3. 在无亲本数据的情况下，利用至少30倍覆盖度的HiFi数据和至少30倍覆盖度的Hi-C数据也可以获得二倍体生物的单倍型解决的组装结果。
                                                    4. 它建立在分型 hifiasm 组装图 （assembly graphs）的基础上，但在序列分类（sequence partition）方面与已发表的 hifiasm (trio) 算法不同。
                                                    5. 在 hifiasm graph中，每个节点（node）都是由相位正确的 HiFi reads组装而成的unitig，每条边（edge）代表两个unitigs之间的重叠。
                                                    6. Hifiasm（trio）算法在亲本 k-mers 的unitigs中标记reads，但 Hifiasm（Hi-C）用 Hi-C reads对相对较短的unitigs进行分类。
                                                      7. @@ -12598,7 +12598,7 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                    Haplotype-resolved assembly using Hi-C data -

                                                    Figure 4. Hifiasm（Hi-C）算法 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x

                                                    +

                                                    Figure 4. Hifiasm（Hi-C）算法 图片来源：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x

                                                    3.3. Hifiasm（Hi-C）算法与其他工具相比的优势

                                                    与现有基于Hi-C组装单倍体基因组的方法不同，Hifiasm（Hi-C）算法直接在 HiFi 组装图上运行，并将 Hi-C read mapping、分型（phasing）和组装紧密集成到一个单一的可执行程序中，而不依赖外部工具。它更易于使用，运行速度更快。

                                                    4. references

                                                    1. Hifiasm paper：https://www.nature.com/articles/s41592-020-01056-5
                                                      2. @@ -12679,20 +12679,21 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                      1. 命令
                                                      -
                                                      yak count -b37 -t16 -o pat.yak <(cat paternal_1.fq.gz paternal_2.fq.gz) <(cat paternal_1.fq.gz paternal_2.fq.gz)
                                                      yak count -b37 -t16 -o mat.yak <(cat maternal_1.fq.gz maternal_2.fq.gz) <(cat maternal_1.fq.gz maternal_2.fq.gz)
                                                      hifiasm -o sample_prefix -t 32 -1 pat.yak -2 mat.yak Hifi.fq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                      +
                                                      # trio-binning模式需要额外安装yak，两种安装方式任选一种
                                                      # source code
                                                      git clone https://github.com/lh3/yak
                                                      cd yak && make
                                                      # bioncda
                                                      conda install -c bioconda yak

                                                      # 运行组装
                                                      yak count -b37 -t16 -o pat.yak <(cat paternal_1.fq.gz paternal_2.fq.gz) <(cat paternal_1.fq.gz paternal_2.fq.gz)
                                                      yak count -b37 -t16 -o mat.yak <(cat maternal_1.fq.gz maternal_2.fq.gz) <(cat maternal_1.fq.gz maternal_2.fq.gz)
                                                      hifiasm -o sample_prefix -t 32 -1 pat.yak -2 mat.yak Hifi.fq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                        -
                                                      1. 参数
                                                        2. +
                                                      2. 参数解释
                                                        -
                                                      • 多个父本paternal数据和多个母本maternal数据同时使用
                                                        • +
                                                      • 命令中Illumina双端测序的父本paternal数据和母本maternal数据同时使用

                                                      4. Hi-C Integrated assembly 模式（HiFi数据+Hi-C数据）

                                                      1. 介绍
                                                      • 当Hi-C数据可用时，可以生成一对解析的单倍型的组装。
                                                        • -
                                                      • 李恒团队2022年在Nature biotechnology上发表论文Haplotype-resolved assembly of diploid genomes without parental data（https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x），在Hifiasm中引入了Hi-C Integrated assembly 模式。Hi-C Integrated assembly模式针对PacBio HiFi (High-Fidelity) 长读长测序技术和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 测序技术进行了全新的设计。
                                                        • +
                                                      • 李恒团队2022年在Nature biotechnology上发表论文Haplotype-resolved assembly of diploid genomes without parental data（https://www.nature.com/articles/s41587-022-01261-x），在Hifiasm中引入了Hi-C Integrated assembly 模式。
                                                        • +
                                                      • Hi-C Integrated assembly模式针对PacBio HiFi (High-Fidelity) 长读长测序技术和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 测序技术进行了全新的设计。
                                                      • 该算法结合了HiFi数据中精确的局部单倍型信息和Hi-C数据中的长距离互作用信息以达到全局定相 (phasing)，从而获得不依赖亲本信息的染色体级别的单倍型组装结果。为了进一步提高组装质量，作者充分利用了组装图中的结构信息，以及其前期研究中的Graph-binning等策略。
                                                      • 这个模式组装后的基因组还未挂载在染色体上，仍然需要Juicer+3ddna+juicebox等软件进行染色体挂载。
                                                      • 这个模式的数据最易获得，所以也很常用。
                                                        • @@ -12701,7 +12702,7 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                      • 命令
                                                      -
                                                    • nohup hifiasm -o sample_prefix -t 32 --h1 HiC_1.fq.gz --h2 ample_HiC_2.fq.gz Hifi.fq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                      • +
                                                    • nohup hifiasm -o sample_prefix -t 32 --h1 HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                    1. 参数
                                                      2. @@ -12850,59 +12851,59 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                    2. A行示例： A ptg000001l 0 - m84075_240209_054407_s3/1115221/ccs 0 13485 id:i:711340 HG:A:a
                                                    3. A行的每一列的含义如下：
                                                  - +
                                                  - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - +

                                                  Col

                                                  Type

                                                  Description

                                                  1

                                                  string

                                                  Should be always A

                                                  Should be always A

                                                  2

                                                  string

                                                  Contig/unitig name

                                                  3

                                                  int

                                                  Contig/unitig start coordinate of subregion constructed by read

                                                  4

                                                  char

                                                  Read strand: “+” or “-”

                                                  5

                                                  string

                                                  Read name

                                                  6

                                                  int

                                                  Read start coordinate of subregion which is used to construct contig/unitig

                                                  7

                                                  int

                                                  Read end coordinate of subregion which is used to construct contig/unitig

                                                  8

                                                  id:i:int

                                                  Read ID

                                                  9

                                                  HG:A:char

                                                  Haplotype status of read. HG:A:a, HG:A:p, HG:A:m indicate read is non-binnable, father/hap1-specific and mother/hap2-specific, respectively.

                                                  Haplotype status of read. HG:A:a, HG:A:p, HG:A:m indicate read is non-binnable, father/hap1-specific and mother/hap2-specific, respectively.
                                                  @@ -12916,11 +12917,15 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                  1. 先用默认参数跑一遍
                                                  -

                                                  nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &

                                                  +
                                                    +
                                                  • nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                    • +
                                                  1. 查看hifiasm.log文件，如果k-mer plot只有一个峰代表是纯合子样本，则加-l0参数关闭purge duplication步骤，再跑一遍。
                                                  -

                                                  nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 -l0 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &

                                                  +
                                                    +
                                                  • nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 -l0 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                                    • +
                                                  1. 查看hifiasm.log文件，如果k-mer plot有两个峰代表是杂合子样本。
                                                  @@ -12928,8 +12933,8 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                2. 首先，确定纯合子覆盖值（Ho_coverage值，即homozygous read coverage threshold）是否判断正确，接近k-mer图中的较大的峰值Ho_peak值即为判断正确。
                                                3. 然后，检查碱基数量是否异常。Hi-C模式下，纯合碱基比杂合碱基要多即为异常，则会错误判断纯合子覆盖度值。
                                                4. 如果有问题，需要使用参数–hom-cov指定纯合子覆盖度为纯合峰值（Ho_peak值，比如90）重跑一遍。
                                                  5. +
                                                5. nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 --hom-cov 90 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &
                                            -

                                            nohup hifiasm -o sample_prefix -t 48 --hom-cov 90 --h1 sample_HiC_1.fq.gz --h2 sample_HiC_2.fq.gz Hifi.fastq.gz 2>&1 > hifiasm.log &

                                            1. 检查组装结果是否异常，调整参数
                                            @@ -13275,219 +13280,48 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                          5. 识别结构变异：短读长无法识别的结构变异用长读长的reads可以识别了。

                                          4.3. PacBio SMRT测序

                                          Pacific Biosciences（PacBio）公司三代测序平台Sequel & Sequel II基于零模波导特性（zero-mode wave-guides, ZMWs）的单分子实时测序技术（SMRT）进行测序。

                                          -

                                          4.3.1. PacBio三代建库

                                            -
                                          1. PacBio三代建库是在已打断为一定长度（10-20kb或更长）的双链DNA分子两端连接带有发卡（hairpin）结构的PacBio接头（adaptor），使DNA分子形成“哑铃形”SMRTbell文库。
                                            2. -
                                          -

                                          4.3.2. SMRT测序原理

                                            -
                                          1. SMRT 测序是以SMRT Cell为载体，SMRT Cell是纳米制造的，不可回收的消耗品，也叫芯片。每个SMRT Cell上布满了数百万个零模波导孔（ZMW），也被称为well。零模波导孔（ZMW）是单分子实时测序的最小场所。Sequel 系统一个SMRT Cell上面 1M（一百万）个ZMWs， Sequel II系统一个Cell上支持8M个ZMWs。
                                            2. -
                                          2. 测序时DNA聚合酶和一条模板分子被瞄定在ZMW孔底部进行反应，位于小孔底部的激发光能够激发核苷酸底物上的荧光标记，进而通过监测系统的相机（CCD）将荧光信号记录下来，从而获得碱基信息。这一过程在环化的文库上不断重复进行，从而完成测序。
                                            3. -
                                          3. 整个测序过程 DNA 分子不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。
                                            4. -
                                          -

                                          4.3.3. SMRT测序模式

                                          PacBio sequel II平台支持CLR（Continuous Long Reads）和CCS（Circular Consensus Sequencing）两种测序模式。

                                          -
                                            -
                                          1. CLR模式适用超长片段文库（> 25 kb），存储有效数据的文件一般命名为* .subreads.bam。对subreads不再进行后续处理。
                                            2. -
                                          2. CCS模式则适用于普通长度片段文库(< 25 kb)，存储数据的* .subreads.bam文件（subreads）需要后续处理。由于测序过程中每条polymerase read中包含同一分子的多条pass信息，通过一致性校正后（intra-molecular consensus），得到一条唯一的read，称为CCS read，这个校正过程会显著提升测序准确率（从86%提升到99.9%）。质量值大于Q20的CCS read称为HiFi reads(High fidelity reads)，存放于.hifi_reads.bam文件中，这个文件将用于下游的信息分析。
                                            3. -
                                          -

                                          4.4. Nanopore 纳米孔测序

                                          相较PacBio的三代测序技术，Oxford Nanopore Technology公司的Nanopore测序（又叫纳米孔测序）技术使用的较少。

                                          -
                                            -
                                          1. Nanopore测序原理
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • Nanopore测序技术采用的是一种与SMRT不同的原理，即单链 DNA 或 RNA 分子穿过纳米孔，记录核苷酸通过孔时的周围电场的电流变化。
                                            • -
                                          -
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                                          1. Nanopore测序平台
                                            2. -
                                          -
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                                          • Nanopore测序的特点是便携性和多功能性。手持式 MinION 设备使研究人员能够在传统实验室之外进行测序实验，从而实现对传染病爆发、环境研究甚至太空任务的实时监控。
                                            • -
                                          • PromethION 是该技术的高通量版本，可提升测序能力以应对更大的项目，包括全基因组测序和元基因组学。
                                            • -
                                          -
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                                          1. Nanopore测序特点
                                            2. -
                                          -
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                                          • 缺点：插入片段长度最高可达2.3Mbp，通常比PacBio三代reads（30kb）短。
                                            • -
                                          • 测序reads的准确率约为92-97%。
                                            • -
                                          • 优点：便携和快速。
                                            • -
                                          • 优点：纳米孔测序的实时分析。
                                            • -
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                                          5. references

                                            -
                                          1. 维基-DNA sequencing：https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#:~:text=Sequencing%20is%20used%20in%20molecular,and%20identify%20potential%20drug%20targets.
                                            2. -
                                          2. 维基-Sanger测序：https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing
                                            3. -
                                          3. https://biopic.pku.edu.cn/gtlcxzx/ptjs/swxxfx/index.htm
                                            4. -
                                          4. https://www.cnblogs.com/leezx/p/6136297.html
                                            5. -
                                          5. 第一代到第三代基因组测序技术原理：https://www.cnblogs.com/huangshujia/p/3233693.html
                                            6. -
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                                          • 欢迎关注微信公众号：生信技工
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                                          • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
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                                          -]]> - - omics - genome - genome sequencing - - - fasta - third generation sequencing - TGS - PacBio - genome sequencing - long read sequencing - continuous long reads - CLR - circular consensus sequencing - CCS - SMRT - subreads - sanger sequencing - next generation sequencing - NGS - Nanopore - - - - 用k-mer分析进行基因组调查：（二）用Smudgeplot估计倍性 - /2022/12/31/omics_genome.survey_02.Smudgeplot/ - - -

                                          用k-mer分析进行基因组调查系列：

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                                          【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

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                                          1. Smudgeplot

                                          Smudgeplot是2020年与GenomeScope2.0一起发表的用于估计物种的倍性的软件。开发者计划接下来把Smudgeplot整合进GenomeScope。

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                                          2. Smudgeplot原理

                                          Smudgeplot从k-mer数据库中提取杂合k-mer对，然后训练杂合k-mer对。

                                          -

                                          通过比较k-mer对覆盖度的总数(CovA + CovB)和相对覆盖度(CovB / (CovA + CovB))，统计杂合k-mers对的数量，Smudgeplot可以解析基因组结构。

                                          -

                                          3. Smudgeplot安装

                                            -
                                          1. 依赖
                                            依赖是tbenavi1/KMC和GenomeScope2.0。
                                            2. -
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                                            -
                                          1. 安装
                                            conda install -c bioconda smudgeplot #conda安装
                                            2. -
                                          -

                                          4. Smudgeplot使用

                                          4.1. KMC+Smudgeplot

                                          4.1.1. 用KMC计算k-mer频率，生成k-mer频率表

                                            -

                                          1. 运行

                                            -
                                            mkdir tmp
                                            ls *.fastq.gz > FILES
                                            kmc -k21 -t8 -m64 -ci1 -cs10000 @FILES kmcdb tmp #计算k-mer频率，生成二进制文件kmcdb.kmc_pre和kmcdb.kmc_suf
                                            kmc_tools transform kmcdb histogram kmcdb_k21.hist -cx10000 #生成k-mer频数直方表kmcdb_k21.hist
                                            rm -rf tmp
                                            -
                                            2. -

                                          2. kmc命令参数：

                                            -
                                            3. -
                                          -
                                            -
                                          • -k21：k-mer长度设置为21
                                            • -
                                          • -t8：线程8
                                            • -
                                          • -m64：内存64G，设置使用RAM的大致数量，范围1-1024。
                                            • -
                                          • -ci1 -cs10000：统计k-mer coverages覆盖度范围在[1-10000]的。
                                            • -
                                          • @FILES：保存了输入文件列表的文件名为FILES
                                            • -
                                          • kmcdb：KMC数据库的输出文件名前缀
                                            • -
                                          • tmp：临时目录
                                            • -
                                          -
                                            -
                                          1. kmc_tools命令参数：
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • -cx10000：储存在直方图文件中counter的最大值。
                                            • -
                                          -

                                          4.1.2. 选择覆盖阈值

                                            -
                                          • 可以目视检查k-mer直方图，选择覆盖阈值上(U)下(L)限。
                                            • -
                                          • 也可以用命令估计覆盖阈值上(U)下(L)限。L的取值范围是[20-200]，U的取值范围是[500-3000]。
                                            • -
                                          -
                                          L=$(smudgeplot.py cutoff kmcdb_k21.hist L)
                                          U=$(smudgeplot.py cutoff kmcdb_k21.hist U)
                                          echo $L $U # these need to be sane values
                                          - -

                                          4.1.3. 提取阈值范围的k-mers，计算k-mer pairs

                                            -
                                          1. smudge_pairs
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • 用kmc_tools提取k-mers，然后用KMC的smudge_pairs计算k-mer pairs。
                                            • -
                                          • smudge_pairs比smudgeplot.py hetkmers使用更少内存，速度更快地寻找杂合k-mer pairs。
                                              -
                                            • kmc_tools transform kmcdb -ci"$L" -cx"$U" reduce kmcdb_L"$L"_U"$U" 根据L和U过滤，生成二进制文件kmcdb_L10_U680.kmc_pre和kmcdb_L10_U680.kmc_suf
                                              • -
                                            • smudge_pairs kmcdb_L"$L"_U"$U" kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv kmcdb_L"$L"_U"$U"_pairs.tsv > kmcdb_L"$L"_U"$U"_familysizes.tsv
                                              • -
                                            -
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                                          1. smudgeplot.py
                                            2. -
                                          -
                                            -
                                          • 如果没有安装KMC，可以用kmc_dump提取k-mers。
                                            • -
                                          • 然后用smudgeplot.py hetkmers计算k-mer pairs。
                                            • -
                                          • kmc_tools transform kmcdb -ci"$L" -cx"$U" dump -s kmcdb_L"$L"_U"$U".dump #生成kmcdb_L10_U680.dump
                                            • -
                                          • smudgeplot.py hetkmers -o kmcdb_L"$L"_U"$U" < kmcdb_L"$L"_U"$U".dump # 生成kmcdb_L10_U680_coverages.tsv和kmcdb_L10_U680_sequences.tsv，耗时约1h
                                            • -
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                                          4.1.4. 生成热度图(smudgeplot)

                                            -
                                          1. 命令
                                            smudgeplot.py plot kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv -o smudgeplot
                                            2. +

                                            4.3.1. PacBio三代建库

                                              +
                                            1. PacBio三代建库是在已打断为一定长度（10-20kb或更长）的双链DNA分子两端连接带有发卡（hairpin）结构的PacBio接头（adaptor），使DNA分子形成“哑铃形”SMRTbell文库。
                                            -
                                              -
                                            • -o指定输出文件前缀，默认smudgeplot
                                              • -
                                            • -t指定图中的title
                                              • -
                                            -
                                              -
                                            1. 结果
                                              2. +

                                              4.3.2. SMRT测序原理

                                                +
                                              1. SMRT 测序是以SMRT Cell为载体，SMRT Cell是纳米制造的，不可回收的消耗品，也叫芯片。每个SMRT Cell上布满了数百万个零模波导孔（ZMW），也被称为well。零模波导孔（ZMW）是单分子实时测序的最小场所。Sequel 系统一个SMRT Cell上面 1M（一百万）个ZMWs， Sequel II系统一个Cell上支持8M个ZMWs。
                                                2. +
                                              2. 测序时DNA聚合酶和一条模板分子被瞄定在ZMW孔底部进行反应，位于小孔底部的激发光能够激发核苷酸底物上的荧光标记，进而通过监测系统的相机（CCD）将荧光信号记录下来，从而获得碱基信息。这一过程在环化的文库上不断重复进行，从而完成测序。
                                                3. +
                                              3. 整个测序过程 DNA 分子不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。
                                              -
                                                -
                                              • 生成两个基础的热度图。一个log尺度smudgeplot_smudgeplot_log10.png；一个线性尺度smudgeplot_smudgeplot.png
                                                • -
                                              • smudgeplot_summary_table.tsv，下面是文件示例：
                                                • -
                                              -
                                              peak	kmers [#]	kmers [proportion]	summit B / (A + B)	summit A + B
                                              AB	10703792	1	0.49	44.2
                                              - -
                                                -
                                              • smudgeplot_verbose_summary.txt，下面是文件示例：
                                                • -
                                              -
                                              1n coverage estimates (Coverage of every haplotype; Don't confuse with genome coverage whichis (ploidy * 1n coverage).)
                                              * User defined 1n coverage:
                                              * Subset 1n coverage estimate:	16.4
                                              * Highest peak 1n coverage estimate:	23.1
                                              1n coverage used in smudgeplot (one of the three above):	23.1
                                              * Proposed ploidy:	2
                                              * Minimal number of heterozygous loci:	509705
                                              Note: This number is NOT an estimate of the total number heterozygous loci, it's merly setting the lower boundary if the inference of heterozygosity peaks is correct.
                                              * Proportion of heterozygosity carried by pairs in different genome copies (table)
                                                genome_copies propotion_of_heterozygosity
                                              1             2                           1
                                              * Proportion of heterozygosity carried by paralogs:	0
                                              * Summary of all detected peaks (table)
                                                peak kmers [#] kmers [proportion] summit B / (A + B) summit A + B
                                              2   AB  10703792                  1               0.49         44.2
                                              - -
                                                -
                                              • smudgeplot_warnings.txt
                                                • -
                                              -

                                              4.2. jellyfish+Smudgeplot

                                              用jellyfish代替KMC

                                              +

                                              4.3.3. SMRT测序模式

                                              PacBio sequel II平台支持CLR（Continuous Long Reads）和CCS（Circular Consensus Sequencing）两种测序模式。

                                                -

                                              1. 用jellyfish计算k-mer频率，生成k-mer频率表

                                                -
                                                jellyfish count -C -m 21 -s 1000000000 -t 8 *.fastq -o kmer_counts.jf
                                                jellyfish histo kmer_counts.jf > kmer_k21.hist
                                                -
                                                2. -

                                              2. 提取阈值范围的k-mers，计算k-mer pairs

                                                -
                                                L=$(smudgeplot.py cutoff kmer_k21.hist L)
                                                U=$(smudgeplot.py cutoff kmer_k21.hist U)
                                                echo $L $U
                                                jellyfish dump -c -L $L -U $U kmer_counts.jf | smudgeplot.py hetkmers -o kmer_pairs
                                                # note that if you would like use --middle flag, you would have to sort the jellyfish dump first
                                                -
                                                3. -

                                              3. 生成smudgeplot污热度图

                                                -
                                                smudgeplot.py plot kmer_pairs_coverages_2.tsv -o my_genome
                                                4. +
                                              4. CLR模式适用超长片段文库（> 25 kb），存储有效数据的文件一般命名为* .subreads.bam。对subreads不再进行后续处理。
                                                5. +
                                              5. CCS模式则适用于普通长度片段文库(< 25 kb)，存储数据的* .subreads.bam文件（subreads）需要后续处理。由于测序过程中每条polymerase read中包含同一分子的多条pass信息，通过一致性校正后（intra-molecular consensus），得到一条唯一的read，称为CCS read，这个校正过程会显著提升测序准确率（从86%提升到99.9%）。质量值大于Q20的CCS read称为HiFi reads(High fidelity reads)，存放于.hifi_reads.bam文件中，这个文件将用于下游的信息分析。
                                              -

                                              4.3. Smudgeplot结果

                                                -
                                              1. 热度图
                                                2. +

                                                4.4. Nanopore 纳米孔测序

                                                相较PacBio的三代测序技术，Oxford Nanopore Technology公司的Nanopore测序（又叫纳米孔测序）技术使用的较少。

                                                +
                                                  +
                                                1. Nanopore测序原理
                                                  -
                                                • 热度图，横坐标是相对覆盖度 (CovB / (CovA + CovB)) ，纵坐标是总覆盖度 (CovA + CovB) ，颜色是k-mer对的频率。
                                                  • -
                                                • 每个单倍型结构都在图上呈现一个”污点(smudge)”，污点的热度表示单倍型结构在基因组中出现的频率，频率最高的单倍型结构即为预测的物种倍性结果。(比如这个图提供了三倍体的证据，AAB的频率最高)
                                                  • +
                                                • Nanopore测序技术采用的是一种与SMRT不同的原理，即单链 DNA 或 RNA 分子穿过纳米孔，记录核苷酸通过孔时的周围电场的电流变化。
                                                - - -

                                                Figure 5. Smudgeplot热度图。
                                                图片来源： Smudgeplot github

                                                  -
                                                1. smudgeplot_verbose_summary.txt
                                                  2. +
                                                2. Nanopore测序平台
                                                  -
                                                • 文件中可以提取预测的最终倍性结果：“* Proposed ploidy: 2”
                                                  • +
                                                • Nanopore测序的特点是便携性和多功能性。手持式 MinION 设备使研究人员能够在传统实验室之外进行测序实验，从而实现对传染病爆发、环境研究甚至太空任务的实时监控。
                                                  • +
                                                • PromethION 是该技术的高通量版本，可提升测序能力以应对更大的项目，包括全基因组测序和元基因组学。
                                                -

                                                5. KMC/jellyfish结果用于GenomeScope进行基因组调查

                                                  -
                                                • 通过KMC/jellyfish获得的频数分布表结果kmcdb_k21.hist可用于GenomeScope进行基因组调查
                                                  • +
                                                    +
                                                  1. Nanopore测序特点
                                                    2. +
                                                  +
                                                    +
                                                  • 缺点：插入片段长度最高可达2.3Mbp，通常比PacBio三代reads（30kb）短。
                                                    • +
                                                  • 测序reads的准确率约为92-97%。
                                                    • +
                                                  • 优点：便携和快速。
                                                    • +
                                                  • 优点：纳米孔测序的实时分析。
                                                  -

                                                  Rscript genomescope.R kmcdb_k21.hist <k-mer_length> <read_length> <output_dir> [kmer_max] [verbose]

                                                  -

                                                  6. 批量运行脚本

                                                  如果样品数量非常多，可以用脚本自动遍历每个样品来运行。

                                                  -

                                                  把样品名称整理成样品列表（sample.list），修改下面脚本中的/path/to/data/为数据所在路径，即可运行。

                                                  -
                                                  for i in sample.list
                                                  do
                                                  	mkdir $i
                                                  	cd $i
                                                      mkdir tmp

                                                      # 运行KMC，获得频数分布表sample_k21.hist
                                                  	ls /path/to/data/$i* > FILES
                                                  	kmc -k21 -t8 -m64 -ci1 -cs10000 @FILES $i tmp
                                                  	kmc_tools transform $i histogram "$i"_k21.hist -cx10000
                                                      rm -rf tmp

                                                      # 运行genomescope2.0，估计基因组特征（默认是二倍体-p 2）
                                                  	genomescope.R -i "$i"_k21.hist -o ./ -k 21 -n "$i"_genomescope -p 2 >"$i"_genomescope.log 2>&1 &

                                                      # 运行smudgeplot，估计
                                                  	L=$(smudgeplot.py cutoff "${i}"_k21.hist L)
                                                  	U=$(smudgeplot.py cutoff "${i}"_k21.hist U)
                                                  	echo $L $U
                                                  	kmc_tools transform $i -ci"$L" -cx"$U" dump -s "$i"_L"$L"_U"$U".dump
                                                  	smudgeplot.py hetkmers -o "$i"_L"$L"_U"$U" < "$i"_L"$L"_U"$U".dump # 耗时步骤，约1h
                                                  	smudgeplot.py plot "$i"_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv -o $i -t $i
                                                  	cd ..
                                                  done
                                                  - -

                                                  7. references

                                                    -
                                                  1. GenomeScope 2.0 + Smudgeplot paper：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14998-3
                                                    2. -
                                                  2. Smudgeplot github：https://github.com/KamilSJaron/smudgeplot
                                                    3. -
                                                  3. genomescope2.0 github：https://github.com/tbenavi1/genomescope2.0
                                                    4. +

                                                    5. references

                                                      +
                                                    1. 维基-DNA sequencing：https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#:~:text=Sequencing%20is%20used%20in%20molecular,and%20identify%20potential%20drug%20targets.
                                                      2. +
                                                    2. 维基-Sanger测序：https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing
                                                      3. +
                                                    3. https://biopic.pku.edu.cn/gtlcxzx/ptjs/swxxfx/index.htm
                                                      4. +
                                                    4. https://www.cnblogs.com/leezx/p/6136297.html
                                                      5. +
                                                    5. 第一代到第三代基因组测序技术原理：https://www.cnblogs.com/huangshujia/p/3233693.html
                                                      @@ -13498,15 +13332,25 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 omics genome - genome survey + genome sequencing - genome survey - genome - k-mer - GenomeScope - Smudgeplot - KMC + fasta + third generation sequencing + TGS + PacBio + genome sequencing + long read sequencing + continuous long reads + CLR + circular consensus sequencing + CCS + SMRT + subreads + sanger sequencing + next generation sequencing + NGS + Nanopore @@ -13784,10 +13628,10 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer + jellyfish + KMC GenomeScope Smudgeplot - KMC - jellyfish KAT GCE KmerGenie @@ -13888,11 +13732,171 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有

                                                      5.2. R绘制

                                                      R绘制k-mer频数分布曲线初步查看基因组特征。
                                                      获得kmer_plot.png为频数分布曲线，可根据曲线峰值对基因组大小进行计算和预估。

                                                      #R 脚本示例
                                                      kmer <- read.table('sample.histo')
                                                      kmer <- subset(kmer, V1 >=5 & V1 <=500) #对频数范围5-500的数据进行绘制 
                                                      Frequency <- kmer$V1
                                                      Number <- kmer$V2
                                                      png('kmer_plot.png')
                                                      plot(Frequency, Number, type = 'l', col = 'blue')
                                                      dev.off()
                                                      -

                                                      6. references

                                                        -
                                                      1. jellyfish paper：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/27/6/764/234905?login=true
                                                        2. -
                                                      2. jellyfish github：https://github.com/gmarcais/Jellyfish
                                                        3. -
                                                      3. jellyfish参数推荐：https://www.bilibili.com/read/cv16360242
                                                        4. -
                                                      4. chenlianfu blog: jellyfish参数推荐：http://www.chenlianfu.com/?p=806
                                                        5. +

                                                        6. references

                                                          +
                                                        1. jellyfish paper：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/27/6/764/234905?login=true
                                                          2. +
                                                        2. jellyfish github：https://github.com/gmarcais/Jellyfish
                                                          3. +
                                                        3. jellyfish参数推荐：https://www.bilibili.com/read/cv16360242
                                                          4. +
                                                        4. chenlianfu blog: jellyfish参数推荐：http://www.chenlianfu.com/?p=806
                                                          5. +
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                                                          +
                                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                          • +
                                                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                          • +
                                                        +]]> + + omics + genome + genome survey + + + genome survey + genome + k-mer + jellyfish + GenomeScope + + + + 用k-mer分析进行基因组调查：（二）用Smudgeplot估计倍性 + /2022/12/31/omics_genome.survey_02.Smudgeplot/ + + +

                                                        用k-mer分析进行基因组调查系列：

                                                        + +

                                                        【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

                                                        +

                                                        1. Smudgeplot

                                                        Smudgeplot是2020年与GenomeScope2.0一起发表的用于估计物种的倍性的软件。开发者计划接下来把Smudgeplot整合进GenomeScope。

                                                        +

                                                        2. Smudgeplot原理

                                                        Smudgeplot从k-mer数据库中提取杂合k-mer对，然后训练杂合k-mer对。

                                                        +

                                                        通过比较k-mer对覆盖度的总数(CovA + CovB)和相对覆盖度(CovB / (CovA + CovB))，统计杂合k-mers对的数量，Smudgeplot可以解析基因组结构。

                                                        +

                                                        3. Smudgeplot安装

                                                          +
                                                        1. 依赖
                                                          依赖是tbenavi1/KMC和GenomeScope2.0。
                                                          2. +
                                                        + +
                                                          +
                                                        1. 安装
                                                          conda install -c bioconda smudgeplot #conda安装
                                                          2. +
                                                        +

                                                        4. Smudgeplot使用

                                                        4.1. KMC+Smudgeplot

                                                        4.1.1. 用KMC计算k-mer频率，生成k-mer频率表

                                                          +

                                                        1. 运行

                                                          +
                                                          mkdir tmp
                                                          ls *.fastq.gz > FILES
                                                          kmc -k21 -t8 -m64 -ci1 -cs10000 @FILES kmcdb tmp #计算k-mer频率，生成二进制文件kmcdb.kmc_pre和kmcdb.kmc_suf
                                                          kmc_tools transform kmcdb histogram kmcdb_k21.hist -cx10000 #生成k-mer频数直方表kmcdb_k21.hist
                                                          rm -rf tmp
                                                          +
                                                          2. +

                                                        2. kmc命令参数：

                                                          +
                                                          3. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • -k21：k-mer长度设置为21
                                                          • +
                                                        • -t8：线程8
                                                          • +
                                                        • -m64：内存64G，设置使用RAM的大致数量，范围1-1024。
                                                          • +
                                                        • -ci1 -cs10000：统计k-mer coverages覆盖度范围在[1-10000]的。
                                                          • +
                                                        • @FILES：保存了输入文件列表的文件名为FILES
                                                          • +
                                                        • kmcdb：KMC数据库的输出文件名前缀
                                                          • +
                                                        • tmp：临时目录
                                                          • +
                                                        +
                                                          +
                                                        1. kmc_tools命令参数：
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • -cx10000：储存在直方图文件中counter的最大值。
                                                          • +
                                                        +

                                                        4.1.2. 选择覆盖阈值

                                                          +
                                                        • 可以目视检查k-mer直方图，选择覆盖阈值上(U)下(L)限。
                                                          • +
                                                        • 也可以用命令估计覆盖阈值上(U)下(L)限。L的取值范围是[20-200]，U的取值范围是[500-3000]。
                                                          • +
                                                        +
                                                        L=$(smudgeplot.py cutoff kmcdb_k21.hist L)
                                                        U=$(smudgeplot.py cutoff kmcdb_k21.hist U)
                                                        echo $L $U # these need to be sane values
                                                        + +

                                                        4.1.3. 提取阈值范围的k-mers，计算k-mer pairs

                                                          +
                                                        1. smudge_pairs
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 用kmc_tools提取k-mers，然后用KMC的smudge_pairs计算k-mer pairs。
                                                          • +
                                                        • smudge_pairs比smudgeplot.py hetkmers使用更少内存，速度更快地寻找杂合k-mer pairs。
                                                            +
                                                          • kmc_tools transform kmcdb -ci"$L" -cx"$U" reduce kmcdb_L"$L"_U"$U" 根据L和U过滤，生成二进制文件kmcdb_L10_U680.kmc_pre和kmcdb_L10_U680.kmc_suf
                                                            • +
                                                          • smudge_pairs kmcdb_L"$L"_U"$U" kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv kmcdb_L"$L"_U"$U"_pairs.tsv > kmcdb_L"$L"_U"$U"_familysizes.tsv
                                                            • +
                                                          +
                                                          • +
                                                        +
                                                          +
                                                        1. smudgeplot.py
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 如果没有安装KMC，可以用kmc_dump提取k-mers。
                                                          • +
                                                        • 然后用smudgeplot.py hetkmers计算k-mer pairs。
                                                          • +
                                                        • kmc_tools transform kmcdb -ci"$L" -cx"$U" dump -s kmcdb_L"$L"_U"$U".dump #生成kmcdb_L10_U680.dump
                                                          • +
                                                        • smudgeplot.py hetkmers -o kmcdb_L"$L"_U"$U" < kmcdb_L"$L"_U"$U".dump # 生成kmcdb_L10_U680_coverages.tsv和kmcdb_L10_U680_sequences.tsv，耗时约1h
                                                          • +
                                                        +

                                                        4.1.4. 生成热度图(smudgeplot)

                                                          +
                                                        1. 命令
                                                          smudgeplot.py plot kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv -o smudgeplot
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • -o指定输出文件前缀，默认smudgeplot
                                                          • +
                                                        • -t指定图中的title
                                                          • +
                                                        +
                                                          +
                                                        1. 结果
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 生成两个基础的热度图。一个log尺度smudgeplot_smudgeplot_log10.png；一个线性尺度smudgeplot_smudgeplot.png
                                                          • +
                                                        • smudgeplot_summary_table.tsv，下面是文件示例：
                                                          • +
                                                        +
                                                        peak	kmers [#]	kmers [proportion]	summit B / (A + B)	summit A + B
                                                        AB	10703792	1	0.49	44.2
                                                        + +
                                                          +
                                                        • smudgeplot_verbose_summary.txt，下面是文件示例：
                                                          • +
                                                        +
                                                        1n coverage estimates (Coverage of every haplotype; Don't confuse with genome coverage whichis (ploidy * 1n coverage).)
                                                        * User defined 1n coverage:
                                                        * Subset 1n coverage estimate:	16.4
                                                        * Highest peak 1n coverage estimate:	23.1
                                                        1n coverage used in smudgeplot (one of the three above):	23.1
                                                        * Proposed ploidy:	2
                                                        * Minimal number of heterozygous loci:	509705
                                                        Note: This number is NOT an estimate of the total number heterozygous loci, it's merly setting the lower boundary if the inference of heterozygosity peaks is correct.
                                                        * Proportion of heterozygosity carried by pairs in different genome copies (table)
                                                          genome_copies propotion_of_heterozygosity
                                                        1             2                           1
                                                        * Proportion of heterozygosity carried by paralogs:	0
                                                        * Summary of all detected peaks (table)
                                                          peak kmers [#] kmers [proportion] summit B / (A + B) summit A + B
                                                        2   AB  10703792                  1               0.49         44.2
                                                        + +
                                                          +
                                                        • smudgeplot_warnings.txt
                                                          • +
                                                        +

                                                        4.2. jellyfish+Smudgeplot

                                                        用jellyfish代替KMC

                                                        +
                                                          +

                                                        1. 用jellyfish计算k-mer频率，生成k-mer频率表

                                                          +
                                                          jellyfish count -C -m 21 -s 1000000000 -t 8 *.fastq -o kmer_counts.jf
                                                          jellyfish histo kmer_counts.jf > kmer_k21.hist
                                                          +
                                                          2. +

                                                        2. 提取阈值范围的k-mers，计算k-mer pairs

                                                          +
                                                          L=$(smudgeplot.py cutoff kmer_k21.hist L)
                                                          U=$(smudgeplot.py cutoff kmer_k21.hist U)
                                                          echo $L $U
                                                          jellyfish dump -c -L $L -U $U kmer_counts.jf | smudgeplot.py hetkmers -o kmer_pairs
                                                          # note that if you would like use --middle flag, you would have to sort the jellyfish dump first
                                                          +
                                                          3. +

                                                        3. 生成smudgeplot污热度图

                                                          +
                                                          smudgeplot.py plot kmer_pairs_coverages_2.tsv -o my_genome
                                                          4. +
                                                        +

                                                        4.3. Smudgeplot结果

                                                          +
                                                        1. 热度图
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 热度图，横坐标是相对覆盖度 (CovB / (CovA + CovB)) ，纵坐标是总覆盖度 (CovA + CovB) ，颜色是k-mer对的频率。
                                                          • +
                                                        • 每个单倍型结构都在图上呈现一个”污点(smudge)”，污点的热度表示单倍型结构在基因组中出现的频率，频率最高的单倍型结构即为预测的物种倍性结果。(比如这个图提供了三倍体的证据，AAB的频率最高)
                                                          • +
                                                        + + +

                                                        Figure 5. Smudgeplot热度图。
                                                        图片来源： Smudgeplot github

                                                        +
                                                          +
                                                        1. smudgeplot_verbose_summary.txt
                                                          2. +
                                                        +
                                                          +
                                                        • 文件中可以提取预测的最终倍性结果：“* Proposed ploidy: 2”
                                                          • +
                                                        +

                                                        5. KMC/jellyfish结果用于GenomeScope进行基因组调查

                                                          +
                                                        • 通过KMC/jellyfish获得的频数分布表结果kmcdb_k21.hist可用于GenomeScope进行基因组调查
                                                          • +
                                                        +

                                                        Rscript genomescope.R kmcdb_k21.hist <k-mer_length> <read_length> <output_dir> [kmer_max] [verbose]

                                                        +

                                                        6. 批量运行脚本

                                                        如果样品数量非常多，可以用脚本自动遍历每个样品来运行。

                                                        +

                                                        把样品名称整理成样品列表（sample.list），修改下面脚本中的/path/to/data/为数据所在路径，即可运行。

                                                        +
                                                        for i in sample.list
                                                        do
                                                        	mkdir $i
                                                        	cd $i
                                                            mkdir tmp

                                                            # 运行KMC，获得频数分布表sample_k21.hist
                                                        	ls /path/to/data/$i* > FILES
                                                        	kmc -k21 -t8 -m64 -ci1 -cs10000 @FILES $i tmp
                                                        	kmc_tools transform $i histogram "$i"_k21.hist -cx10000
                                                            rm -rf tmp

                                                            # 运行genomescope2.0，估计基因组特征（默认是二倍体-p 2）
                                                        	genomescope.R -i "$i"_k21.hist -o ./ -k 21 -n "$i"_genomescope -p 2 >"$i"_genomescope.log 2>&1 &

                                                            # 运行smudgeplot，估计
                                                        	L=$(smudgeplot.py cutoff "${i}"_k21.hist L)
                                                        	U=$(smudgeplot.py cutoff "${i}"_k21.hist U)
                                                        	echo $L $U
                                                        	kmc_tools transform $i -ci"$L" -cx"$U" dump -s "$i"_L"$L"_U"$U".dump
                                                        	smudgeplot.py hetkmers -o "$i"_L"$L"_U"$U" < "$i"_L"$L"_U"$U".dump # 耗时步骤，约1h
                                                        	smudgeplot.py plot "$i"_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv -o $i -t $i
                                                        	cd ..
                                                        done
                                                        + +

                                                        7. references

                                                          +
                                                        1. GenomeScope 2.0 + Smudgeplot paper：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14998-3
                                                          2. +
                                                        2. Smudgeplot github：https://github.com/KamilSJaron/smudgeplot
                                                          3. +
                                                        3. genomescope2.0 github：https://github.com/tbenavi1/genomescope2.0
                                                          @@ -13909,8 +13913,9 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer + KMC GenomeScope - jellyfish + Smudgeplot @@ -14023,8 +14028,8 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer - GenomeScope KMC + GenomeScope @@ -14163,15 +14168,15 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer + KMC GenomeScope Smudgeplot - KMC - 用k-mer分析进行基因组调查：（六）用GCE分步实现 - /2022/06/07/omics_genome.survey_06.GCE/ - + 用k-mer分析进行基因组调查：（七）用KmerGenie一步实现 + /2022/06/19/omics_genome.survey_07.KmerGenie/ +

                                                          用k-mer分析进行基因组调查系列：

                                                            @@ -14186,132 +14191,104 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有

                                                            【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

                                                            1. k-mer进行基因组调查的软件

                                                            k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计和基因组特征评估两步。

                                                              -
                                                            • GCE可以分步实现两步。第一步k-mer频数统计和第二步基因组特征评估。
                                                              • -
                                                            • GCE第一步的结果sample.histo可以用在GenomeScope和其他基因组特征评估的软件上，实现第二步。
                                                              • +
                                                            • KmerGenie可以同时实现两步。第一步k-mer频数统计和第二步基因组特征评估。
                                                              • +
                                                            • KmerGenie第一步的结果可用于其他软件第二步基因组特征评估。
                                                              • +
                                                            • KmerGenie可以同时分析多个预设的k-mers，并选出一个最佳基因组组装k-mer值。
                                                            -

                                                            2. GCE 简介

                                                            GCE (genomic charactor estimator)是华大基因在2013年开发的一款基于贝叶斯模型的用于基因组调查的软件，在2020年发布了版本v2。

                                                            -

                                                            3. GCE 安装

                                                            3.1. GCE 下载

                                                              -
                                                            • GCE主要托管在BGI的ftp站点：ftp://ftp.genomics.org.cn/pub/gce。
                                                              • -
                                                            • 也可以在GCE github：https://github.com/fanagislab/GCE上找到。
                                                              • +

                                                              2. KmerGenie 简介

                                                                +
                                                              • KmerGenie在2014年第一次发表，2018年最近一次更新。开发用于基因组组装的参数k的最佳值的选择。
                                                                • +
                                                              • KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/。
                                                                • +
                                                              • 官网包含软件的下载地址，示例报告，和版本更新记录。
                                                              -

                                                              3.2. GCE 安装

                                                                -

                                                              1. 已编译【推荐】

                                                                -
                                                                git clone git@github.com:fanagislab/GCE.git
                                                                -
                                                                2. -

                                                              2. 未编译

                                                                -
                                                                wget ftp://ftp.genomics.org.cn/pub/gce/gce-1.0.2.tar.gz
                                                                tar -xzvf gce-1.0.2.tar.gz #解压缩和解包
                                                                make #编译
                                                                3. -
                                                              -

                                                              文件夹下有kmerfreq和gce两个命令。

                                                              -

                                                              老版本是kmer_freq_hash代替kmerfreq命令。

                                                              -

                                                              4. GCE 运行

                                                              GCE软件里包含两个主要的命令，kmerfreq用来完成第一步k-mer频数统计，gce用来完成第二步基因组特征评估。

                                                              -

                                                              4.1. k-mer频数统计

                                                              4.1.1. 运行

                                                                +

                                                                3. KmerGenie 安装

                                                                在KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/ 下载，目前最新版是18年更新的1.7051。

                                                                +

                                                                安装前需要python（>=2.7）和R支持，我用的anaconda的python，安装运行完成后自动把kmergenie命令添加到了/anaconda3/bin/下面，所以不用再次把kmergenie命令添加到环境变量了。

                                                                +
                                                                wget http://kmergenie.bx.psu.edu/kmergenie-1.7051.tar.gz
                                                                tar -xzvf kmergenie-1.7051.tar.gz
                                                                python setup.py install
                                                                kmergenie -h
                                                                + +

                                                                4. KmerGenie 运行

                                                                1. 命令
                                                                -

                                                                /path/gce-1.0.2/kmerfreq -k 17 -t 24 -p sample input.path &> kmer_freq.log

                                                                -
                                                                  -
                                                                1. 参数
                                                                  2. -
                                                                +

                                                                kmergenie fastq_list.txt -o ./sample -l 17 -k 121 -s 10 -t 4 > sample.log1.txt 2> sample.log2.txt

                                                                  -
                                                                • -k 17：k-mer size
                                                                  • -
                                                                • -t 24：线程
                                                                  • -
                                                                • -p prefix：输出文件的前缀
                                                                  • -
                                                                • input.path：输入数据的路径保存在input.path文本文件
                                                                  • +
                                                                • fastq_list.txt文件保存着fastq文件的位置和文件名，每个文件一行。
                                                                  • +
                                                                • 默认单倍体模式，以k-mer长度17为起始，121为终止，10为间隔逐一测试；程序运行线程数4。
                                                                  • +
                                                                • 结果输出在当前路径下，以sample为结果文件前缀名。
                                                                  • +
                                                                • “sample.log1.txt”和“sample.log2.txt”分别为程序运行时的正确/错误输出日志。
                                                                -

                                                                4.1.2. 输出文件

                                                                  -
                                                                1. sample.kmer.freq.stat：结果文件
                                                                  2. +
                                                                    +
                                                                  1. 参数
                                                                    -
                                                                  • 结果文件sample.kmer.freq.stat，记录了每个k-mer频数的统计信息，用于生成GCE的输入文件。
                                                                    • -
                                                                  • 之前的版本，该文件只统计到第255行，第255行之后的数据合并至第255行，表示k-mer出现频数>=255的片段总数。
                                                                    • -
                                                                  • 现在这个版本(gce-1.0.2)上限变成了65534。
                                                                    • +
                                                                  • –diploid：使用二倍体模式，默认是单倍体模式（haploid）。
                                                                    • +
                                                                  • –one-pass：默认是两次评估（two passes），这个参数设置用来跳过在2bp分辨率上评估k的第二次评估。
                                                                    • +
                                                                  • -k 121：最大的k-mer值，默认是121。
                                                                    • +
                                                                  • -l 15：最小的k-mer值，默认是15。
                                                                    • +
                                                                  • -s 10：在最小和最大的k-mer值间的间隔，默认是10。意味着会进行k=15,25,35…115,121的分析。
                                                                    • +
                                                                  • -e 200：程序运行内存，默认是每个线程200MB。
                                                                    • +
                                                                  • -t 8：线程数。
                                                                    • +
                                                                  • -o histograms：输出文件的前缀，默认是histograms。
                                                                    • +
                                                                  • –debug：开发者使用，输出R脚本。
                                                                    • +
                                                                  • –orig-hist：老程序的评估方法（更慢且准确性更低）。
                                                                  -
                                                                    -
                                                                  1. kmer_freq.log：运行日志文件
                                                                    2. +

                                                                    5. KmerGenie 结果

                                                                      +
                                                                    1. 结果报告文件sample_report.html
                                                                    +

                                                                    下载所有结果文件，打开sample_report.html，报告内容包括：

                                                                      -
                                                                    • 老版本的日志文件还对测序数据进行了简要统计。
                                                                      • -
                                                                    • 在该文件的最下方，统计了k-mer片段总数、k-mer种类数、k-mer平均频数、碱基总数、reads平均长度、基因组大小的粗略估计等信息。
                                                                      • +
                                                                    • 开头以折线图的形式展示出在每种长度k-mer下，估算的基因组大小。
                                                                      • +
                                                                    • 同时给出了最佳k-mer选择数值。其实就是将评估基因组总大小最高的那个k-mer值判定为最佳k-mer，为基因组组装时k-mer的选择提供参考。
                                                                      • +
                                                                    • 折线图的详细说明，包括最佳k-mer的评估规则，以及当测序深度足够高时的k-mer选择等。
                                                                      • +
                                                                    • 每种k-mer的频数分布图，在基因组的k-mer中可根据该图判定基因组杂合度或重复序列比例。
                                                                    -

                                                                    4.2. 基因组特征评估

                                                                    4.2.1. 获取参数

                                                                      -
                                                                    1. 获取k-mer总数
                                                                      2. -
                                                                    -

                                                                    less sample.kmer.freq.stat | grep "#Kmer indivdual number"

                                                                    -

                                                                    用于gce的-g参数

                                                                      -
                                                                    1. 获取k-mer深度分布表
                                                                      2. +
                                                                    2. 频数分布表sample.histo
                                                                    -

                                                                    less sample.kmer.freq.stat | perl -ne 'next if(/^#/ || /^\s/); print; ' | awk '{print $1"\t"$2}' > sample.kmer.freq.stat.2colum

                                                                      -
                                                                    • sample.kmer.freq.stat.2colum文件包含两列数据，第一列是k-mer频数，第二列是频数对应的k-mer的种类数量。
                                                                      • -
                                                                    • 预期第二列数据是泊松分布，有明显峰值；频数最小的(比如小于5)的那几列对应的k-mer数量高是测序错误造成的，频数最大的那列对应的k-mer数量高是把所有大于该列的频数进行合计数量造成的，两端都可以忽略。
                                                                      • +
                                                                    • 包括各k-mer取值下的频数分布表sample.histo和对应的频数分布图sample.histo.pdf。
                                                                      • +
                                                                    • 如果想用某个k-mer的频数分布表做基因组特征评估，自己绘制频数分布图，可以使用sample.histo文件。
                                                                    -

                                                                    4.2.2. 运行gce

                                                                      -
                                                                    1. 纯合模式
                                                                      2. -
                                                                    -

                                                                    gce -f sample.kmer.freq.stat.2colum -g 173854609857 > gce.table 2> gce.log

                                                                    -
                                                                      -
                                                                    1. 杂合模式
                                                                      2. -
                                                                    -

                                                                    gce -f sample.kmer.freq.stat.2colum -g 173854609857 -H 1 -c 75 > gce2.table 2> gce2.log

                                                                      -
                                                                    1. 开发者建议
                                                                      2. +
                                                                    2. 所有k-mer取值评估的基因组大小记录在sample.dat
                                                                    -

                                                                    对于不能判断纯合还是杂合的数据，可以先运行纯合模式，获得初始峰值(raw_peak)，即k-mer的期望深度，用作-c参数。

                                                                    -

                                                                    然后再用-c参数和-H 1参数运行杂合模式。最后比较两种模式的结果，从而判断哪种更适用当前数据。

                                                                    -

                                                                    4.2.3. gce的参数

                                                                    -f和-g是必需参数，其他都为可选参数。

                                                                      -
                                                                    • -f sample.freq.stat.2colum：k-mer频数分布表。
                                                                      • -
                                                                    • -g 173854609857：k-mer片段总数，通过上面命令获取，或者查看kmer_freq.log获取。
                                                                      • -
                                                                    • -H 1：默认是0。homozygous mode 纯合模式(0)，heterozgyous mode 杂合模式(1)。
                                                                      • -
                                                                    • -c 75：独特的k-mer的期望深度，通过肉眼检查sample.gce.table的峰值获取。
                                                                      • -
                                                                    • -b 1：有bias(1)，无(0)bias，默认是0。
                                                                      • -
                                                                    • -m 1：评估模型，离散模型(0)，连续模型(1)，默认是0。
                                                                      • -
                                                                    • -M 1500：设置最大深度，默认1500，大于1500的会被忽略。
                                                                      • -
                                                                    • -D 1：期望值的精度，默认是1。
                                                                      • +
                                                                    • 包括sample.dat和sample.dat.pdf。
                                                                    -

                                                                    4.2.4. 结果

                                                                    生成两个文件：gce.table和gce.log。gce.table保存了用于作图的数据，gce.log日志文件最后记录了基因组特征评估结果的统计。

                                                                    -
                                                                      -
                                                                    1. gce.log文件最后记录了如下内容：
                                                                      2. +

                                                                      6. notes

                                                                        +
                                                                      1. 二倍体模式
                                                                      -
                                                                      raw_peak        effective_kmer_species  effective_kmer_individuals      coverage_depth  genome_size     a[1]    b[1]
                                                                      75      742400596       168346645871    75.8021 2.22087e+09     0.663012        0.271515
                                                                      - -

                                                                      含义：

                                                                      -
                                                                        -
                                                                      • raw_peak： 覆盖度为 75 的 kmer 的种类数最多，为主峰。
                                                                        • -
                                                                      • effective_kmer_species：真实的k-mer种类的总数(去除测序错误造成的低频k-mers)
                                                                        • -
                                                                      • effective_kmer_individuals：真实的k-mer个体的总数(去除测序错误造成的低频k-mers)
                                                                        • -
                                                                      • coverage_depth：估算出的真实k-mers的覆盖深度
                                                                        • -
                                                                      • genome_size：基因组大小。
                                                                        • -
                                                                      -

                                                                      genome_size = effective_kmer_individuals / coverage_depth

                                                                        -
                                                                      • a[1]： uniqe kmers (在基因组上仅出现 1 次的 kmer ) 的种类数占总种类数的比例。
                                                                        • -
                                                                      • b[1]： uniqe kmers (在基因组上仅出现 1 次的 kmer ) 的个体数占总个体数的比例。该值代表着基因组上拷贝数为 1 的序列比例。
                                                                        • +
                                                                      • 如果待测物种是低杂合低重复的简单基因组，则使用单倍体模式。
                                                                        • +
                                                                      • 如果是复杂基因组，使用二倍体模式。
                                                                        • +
                                                                      • 如果不确定基因组简单还是复杂，可以先用单倍体模式运行，根据结果中是否有明显杂合峰判断，再运行二倍体模式。
                                                                        -
                                                                      1. 如果使用杂合模式-H 1，则会在gce.log文件最后额外得到下面信息：
                                                                        2. +
                                                                      2. KmerGenie软件默认将k-mer频数曲线的纵坐标进行了log10转化
                                                                        可以通过修改脚本来更改展示效果：
                                                                        -
                                                                      • a[1/2]：a[1/2]=0.223671表示在所有的 uniqe kmers 种类中，有 0.223671 比例的 kmer 属于杂合 kmer 。
                                                                        • -
                                                                      • b[1/2]：a[1/2]=0.326934 表示在所有的 uniqe kmers 个体中，有 0.326934 比例的 kmer 属于杂合 kmer 。
                                                                        通过计算，还可以获得的信息：
                                                                        • -
                                                                      • k-mer种类的杂合率 kmer-species heterozygous ratio = 0.125918，0.125918 是由 a[1/2] 计算出来的。
                                                                        • +
                                                                      • 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数log='y'设置的log10转化，可以通过去除log='y'参数来展示未log10转化的原始坐标。
                                                                        • +
                                                                      • 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数covNormalized改为covNormalized[-c(1:5)]来过滤掉Abundance<5的区域。
                                                                      -

                                                                      $$0.125918 = a[1/2] / （ 2- a[1/2] )$$

                                                                      +
                                                                        +
                                                                      1. k-mer取值
                                                                        2. +
                                                                        -
                                                                      • 重复序列的含量 = $$1 - b[1/2] - b[1]$$
                                                                        • +
                                                                      • KmerGenie软件是用于二代数据组装基因组推荐k-mer参数的。推荐的最佳k-mer是评估基因组最大的对应的k-mer。
                                                                        • +
                                                                      • 在基因组组装时，k-mer的取值受测序深度的影响，若测序深度越高，可选择更高的k-mer进行尝试组装，以得到更长更完整的contigs序列。
                                                                        • +
                                                                      • 但若在低深度测序模式下使用较高的k-mer进行组装时，就会引入较高的错误率。表现为k-mer频数分布曲线（纵坐标未进行log10转化的）的左侧由于测序错误导致的低频k-mer数量未随着k-mer频数升高下降至最低即产生了上升趋势。
                                                                        • +
                                                                      • 用KmerGenie软件做基因组调查时，可以根据每个k-mer值的频数分布图结果选择更为合适的k-mer值做基因组特征评估。
                                                                      -

                                                                      5. references

                                                                        -
                                                                      1. GCE github：https://github.com/fanagislab/GCE
                                                                        2. -
                                                                      2. kmerfreq：https://github.com/fanagislab/kmerfreq
                                                                        3. -
                                                                      3. GCE paper：https://arxiv.org/abs/1308.2012
                                                                        4. -
                                                                      4. GCE blog：http://www.chenlianfu.com/?p=2335
                                                                        5. +

                                                                        7. references

                                                                          +
                                                                        1. KmerGenie website：http://kmergenie.bx.psu.edu/
                                                                          2. +
                                                                        2. KmerGenie paper：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/30/1/31/235479
                                                                          3. +
                                                                        3. http://blog.sciencenet.cn/blog-3406804-1159967.html
                                                                          4. +
                                                                        4. https://www.jianshu.com/p/0251b55977c0
                                                                        • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                        • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                        -]]> + +]]> omics genome @@ -14321,14 +14298,13 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer - GCE - kmerfreq + KmerGenie - 用k-mer分析进行基因组调查：（七）用KmerGenie一步实现 - /2022/06/19/omics_genome.survey_07.KmerGenie/ - + 用k-mer分析进行基因组调查：（六）用GCE分步实现 + /2022/06/07/omics_genome.survey_06.GCE/ +

                                                                        用k-mer分析进行基因组调查系列：

                                                                          @@ -14343,104 +14319,132 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有

                                                                          【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

                                                                          1. k-mer进行基因组调查的软件

                                                                          k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计和基因组特征评估两步。

                                                                            -
                                                                          • KmerGenie可以同时实现两步。第一步k-mer频数统计和第二步基因组特征评估。
                                                                            • -
                                                                          • KmerGenie第一步的结果可用于其他软件第二步基因组特征评估。
                                                                            • -
                                                                          • KmerGenie可以同时分析多个预设的k-mers，并选出一个最佳基因组组装k-mer值。
                                                                            • +
                                                                          • GCE可以分步实现两步。第一步k-mer频数统计和第二步基因组特征评估。
                                                                            • +
                                                                          • GCE第一步的结果sample.histo可以用在GenomeScope和其他基因组特征评估的软件上，实现第二步。
                                                                          -

                                                                          2. KmerGenie 简介

                                                                            -
                                                                          • KmerGenie在2014年第一次发表，2018年最近一次更新。开发用于基因组组装的参数k的最佳值的选择。
                                                                            • -
                                                                          • KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/。
                                                                            • -
                                                                          • 官网包含软件的下载地址，示例报告，和版本更新记录。
                                                                            • +

                                                                            2. GCE 简介

                                                                            GCE (genomic charactor estimator)是华大基因在2013年开发的一款基于贝叶斯模型的用于基因组调查的软件，在2020年发布了版本v2。

                                                                            +

                                                                            3. GCE 安装

                                                                            3.1. GCE 下载

                                                                            -

                                                                            3. KmerGenie 安装

                                                                            在KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/ 下载，目前最新版是18年更新的1.7051。

                                                                            -

                                                                            安装前需要python（>=2.7）和R支持，我用的anaconda的python，安装运行完成后自动把kmergenie命令添加到了/anaconda3/bin/下面，所以不用再次把kmergenie命令添加到环境变量了。

                                                                            -
                                                                            wget http://kmergenie.bx.psu.edu/kmergenie-1.7051.tar.gz
                                                                            tar -xzvf kmergenie-1.7051.tar.gz
                                                                            python setup.py install
                                                                            kmergenie -h
                                                                            - -

                                                                            4. KmerGenie 运行

                                                                              +

                                                                              3.2. GCE 安装

                                                                                +

                                                                              1. 已编译【推荐】

                                                                                +
                                                                                git clone git@github.com:fanagislab/GCE.git
                                                                                +
                                                                                2. +

                                                                              2. 未编译

                                                                                +
                                                                                wget ftp://ftp.genomics.org.cn/pub/gce/gce-1.0.2.tar.gz
                                                                                tar -xzvf gce-1.0.2.tar.gz #解压缩和解包
                                                                                make #编译
                                                                                3. +
                                                                              +

                                                                              文件夹下有kmerfreq和gce两个命令。

                                                                              +

                                                                              老版本是kmer_freq_hash代替kmerfreq命令。

                                                                              +

                                                                              4. GCE 运行

                                                                              GCE软件里包含两个主要的命令，kmerfreq用来完成第一步k-mer频数统计，gce用来完成第二步基因组特征评估。

                                                                              +

                                                                              4.1. k-mer频数统计

                                                                              4.1.1. 运行

                                                                              1. 命令
                                                                              -

                                                                              kmergenie fastq_list.txt -o ./sample -l 17 -k 121 -s 10 -t 4 > sample.log1.txt 2> sample.log2.txt

                                                                              -
                                                                                -
                                                                              • fastq_list.txt文件保存着fastq文件的位置和文件名，每个文件一行。
                                                                                • -
                                                                              • 默认单倍体模式，以k-mer长度17为起始，121为终止，10为间隔逐一测试；程序运行线程数4。
                                                                                • -
                                                                              • 结果输出在当前路径下，以sample为结果文件前缀名。
                                                                                • -
                                                                              • “sample.log1.txt”和“sample.log2.txt”分别为程序运行时的正确/错误输出日志。
                                                                                • -
                                                                              +

                                                                              /path/gce-1.0.2/kmerfreq -k 17 -t 24 -p sample input.path &> kmer_freq.log

                                                                              1. 参数
                                                                                -
                                                                              • –diploid：使用二倍体模式，默认是单倍体模式（haploid）。
                                                                                • -
                                                                              • –one-pass：默认是两次评估（two passes），这个参数设置用来跳过在2bp分辨率上评估k的第二次评估。
                                                                                • -
                                                                              • -k 121：最大的k-mer值，默认是121。
                                                                                • -
                                                                              • -l 15：最小的k-mer值，默认是15。
                                                                                • -
                                                                              • -s 10：在最小和最大的k-mer值间的间隔，默认是10。意味着会进行k=15,25,35…115,121的分析。
                                                                                • -
                                                                              • -e 200：程序运行内存，默认是每个线程200MB。
                                                                                • -
                                                                              • -t 8：线程数。
                                                                                • -
                                                                              • -o histograms：输出文件的前缀，默认是histograms。
                                                                                • -
                                                                              • –debug：开发者使用，输出R脚本。
                                                                                • -
                                                                              • –orig-hist：老程序的评估方法（更慢且准确性更低）。
                                                                                • +
                                                                              • -k 17：k-mer size
                                                                                • +
                                                                              • -t 24：线程
                                                                                • +
                                                                              • -p prefix：输出文件的前缀
                                                                                • +
                                                                              • input.path：输入数据的路径保存在input.path文本文件
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              4.1.2. 输出文件

                                                                                +
                                                                              1. sample.kmer.freq.stat：结果文件
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 结果文件sample.kmer.freq.stat，记录了每个k-mer频数的统计信息，用于生成GCE的输入文件。
                                                                                • +
                                                                              • 之前的版本，该文件只统计到第255行，第255行之后的数据合并至第255行，表示k-mer出现频数>=255的片段总数。
                                                                                • +
                                                                              • 现在这个版本(gce-1.0.2)上限变成了65534。
                                                                              -

                                                                              5. KmerGenie 结果

                                                                                -
                                                                              1. 结果报告文件sample_report.html
                                                                                2. +
                                                                                  +
                                                                                1. kmer_freq.log：运行日志文件
                                                                                -

                                                                                下载所有结果文件，打开sample_report.html，报告内容包括：

                                                                                  -
                                                                                • 开头以折线图的形式展示出在每种长度k-mer下，估算的基因组大小。
                                                                                  • -
                                                                                • 同时给出了最佳k-mer选择数值。其实就是将评估基因组总大小最高的那个k-mer值判定为最佳k-mer，为基因组组装时k-mer的选择提供参考。
                                                                                  • -
                                                                                • 折线图的详细说明，包括最佳k-mer的评估规则，以及当测序深度足够高时的k-mer选择等。
                                                                                  • -
                                                                                • 每种k-mer的频数分布图，在基因组的k-mer中可根据该图判定基因组杂合度或重复序列比例。
                                                                                  • +
                                                                                • 老版本的日志文件还对测序数据进行了简要统计。
                                                                                  • +
                                                                                • 在该文件的最下方，统计了k-mer片段总数、k-mer种类数、k-mer平均频数、碱基总数、reads平均长度、基因组大小的粗略估计等信息。
                                                                                +

                                                                                4.2. 基因组特征评估

                                                                                4.2.1. 获取参数

                                                                                  +
                                                                                1. 获取k-mer总数
                                                                                  2. +
                                                                                +

                                                                                less sample.kmer.freq.stat | grep "#Kmer indivdual number"

                                                                                +

                                                                                用于gce的-g参数

                                                                                  -
                                                                                1. 频数分布表sample.histo
                                                                                  2. +
                                                                                2. 获取k-mer深度分布表
                                                                                +

                                                                                less sample.kmer.freq.stat | perl -ne 'next if(/^#/ || /^\s/); print; ' | awk '{print $1"\t"$2}' > sample.kmer.freq.stat.2colum

                                                                                  -
                                                                                • 包括各k-mer取值下的频数分布表sample.histo和对应的频数分布图sample.histo.pdf。
                                                                                  • -
                                                                                • 如果想用某个k-mer的频数分布表做基因组特征评估，自己绘制频数分布图，可以使用sample.histo文件。
                                                                                  • +
                                                                                • sample.kmer.freq.stat.2colum文件包含两列数据，第一列是k-mer频数，第二列是频数对应的k-mer的种类数量。
                                                                                  • +
                                                                                • 预期第二列数据是泊松分布，有明显峰值；频数最小的(比如小于5)的那几列对应的k-mer数量高是测序错误造成的，频数最大的那列对应的k-mer数量高是把所有大于该列的频数进行合计数量造成的，两端都可以忽略。
                                                                                +

                                                                                4.2.2. 运行gce

                                                                                  +
                                                                                1. 纯合模式
                                                                                  2. +
                                                                                +

                                                                                gce -f sample.kmer.freq.stat.2colum -g 173854609857 > gce.table 2> gce.log

                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                1. 杂合模式
                                                                                  2. +
                                                                                +

                                                                                gce -f sample.kmer.freq.stat.2colum -g 173854609857 -H 1 -c 75 > gce2.table 2> gce2.log

                                                                                  -
                                                                                1. 所有k-mer取值评估的基因组大小记录在sample.dat
                                                                                  2. +
                                                                                2. 开发者建议
                                                                                +

                                                                                对于不能判断纯合还是杂合的数据，可以先运行纯合模式，获得初始峰值(raw_peak)，即k-mer的期望深度，用作-c参数。

                                                                                +

                                                                                然后再用-c参数和-H 1参数运行杂合模式。最后比较两种模式的结果，从而判断哪种更适用当前数据。

                                                                                +

                                                                                4.2.3. gce的参数

                                                                                -f和-g是必需参数，其他都为可选参数。

                                                                                  -
                                                                                • 包括sample.dat和sample.dat.pdf。
                                                                                  • +
                                                                                • -f sample.freq.stat.2colum：k-mer频数分布表。
                                                                                  • +
                                                                                • -g 173854609857：k-mer片段总数，通过上面命令获取，或者查看kmer_freq.log获取。
                                                                                  • +
                                                                                • -H 1：默认是0。homozygous mode 纯合模式(0)，heterozgyous mode 杂合模式(1)。
                                                                                  • +
                                                                                • -c 75：独特的k-mer的期望深度，通过肉眼检查sample.gce.table的峰值获取。
                                                                                  • +
                                                                                • -b 1：有bias(1)，无(0)bias，默认是0。
                                                                                  • +
                                                                                • -m 1：评估模型，离散模型(0)，连续模型(1)，默认是0。
                                                                                  • +
                                                                                • -M 1500：设置最大深度，默认1500，大于1500的会被忽略。
                                                                                  • +
                                                                                • -D 1：期望值的精度，默认是1。
                                                                                -

                                                                                6. notes

                                                                                  -
                                                                                1. 二倍体模式
                                                                                  2. +

                                                                                  4.2.4. 结果

                                                                                  生成两个文件：gce.table和gce.log。gce.table保存了用于作图的数据，gce.log日志文件最后记录了基因组特征评估结果的统计。

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  1. gce.log文件最后记录了如下内容：
                                                                                  +
                                                                                  raw_peak        effective_kmer_species  effective_kmer_individuals      coverage_depth  genome_size     a[1]    b[1]
                                                                                  75      742400596       168346645871    75.8021 2.22087e+09     0.663012        0.271515
                                                                                  + +

                                                                                  含义：

                                                                                    -
                                                                                  • 如果待测物种是低杂合低重复的简单基因组，则使用单倍体模式。
                                                                                    • -
                                                                                  • 如果是复杂基因组，使用二倍体模式。
                                                                                    • -
                                                                                  • 如果不确定基因组简单还是复杂，可以先用单倍体模式运行，根据结果中是否有明显杂合峰判断，再运行二倍体模式。
                                                                                    • +
                                                                                  • raw_peak： 覆盖度为 75 的 kmer 的种类数最多，为主峰。
                                                                                    • +
                                                                                  • effective_kmer_species：真实的k-mer种类的总数(去除测序错误造成的低频k-mers)
                                                                                    • +
                                                                                  • effective_kmer_individuals：真实的k-mer个体的总数(去除测序错误造成的低频k-mers)
                                                                                    • +
                                                                                  • coverage_depth：估算出的真实k-mers的覆盖深度
                                                                                    • +
                                                                                  • genome_size：基因组大小。
                                                                                    • +
                                                                                  +

                                                                                  genome_size = effective_kmer_individuals / coverage_depth

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • a[1]： uniqe kmers (在基因组上仅出现 1 次的 kmer ) 的种类数占总种类数的比例。
                                                                                    • +
                                                                                  • b[1]： uniqe kmers (在基因组上仅出现 1 次的 kmer ) 的个体数占总个体数的比例。该值代表着基因组上拷贝数为 1 的序列比例。
                                                                                    -
                                                                                  1. KmerGenie软件默认将k-mer频数曲线的纵坐标进行了log10转化
                                                                                    可以通过修改脚本来更改展示效果：
                                                                                    2. +
                                                                                  2. 如果使用杂合模式-H 1，则会在gce.log文件最后额外得到下面信息：
                                                                                    -
                                                                                  • 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数log='y'设置的log10转化，可以通过去除log='y'参数来展示未log10转化的原始坐标。
                                                                                    • -
                                                                                  • 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数covNormalized改为covNormalized[-c(1:5)]来过滤掉Abundance<5的区域。
                                                                                    • +
                                                                                  • a[1/2]：a[1/2]=0.223671表示在所有的 uniqe kmers 种类中，有 0.223671 比例的 kmer 属于杂合 kmer 。
                                                                                    • +
                                                                                  • b[1/2]：a[1/2]=0.326934 表示在所有的 uniqe kmers 个体中，有 0.326934 比例的 kmer 属于杂合 kmer 。
                                                                                    通过计算，还可以获得的信息：
                                                                                    • +
                                                                                  • k-mer种类的杂合率 kmer-species heterozygous ratio = 0.125918，0.125918 是由 a[1/2] 计算出来的。
                                                                                  -
                                                                                    -
                                                                                  1. k-mer取值
                                                                                    2. -
                                                                                  +

                                                                                  $$0.125918 = a[1/2] / （ 2- a[1/2] )$$

                                                                                    -
                                                                                  • KmerGenie软件是用于二代数据组装基因组推荐k-mer参数的。推荐的最佳k-mer是评估基因组最大的对应的k-mer。
                                                                                    • -
                                                                                  • 在基因组组装时，k-mer的取值受测序深度的影响，若测序深度越高，可选择更高的k-mer进行尝试组装，以得到更长更完整的contigs序列。
                                                                                    • -
                                                                                  • 但若在低深度测序模式下使用较高的k-mer进行组装时，就会引入较高的错误率。表现为k-mer频数分布曲线（纵坐标未进行log10转化的）的左侧由于测序错误导致的低频k-mer数量未随着k-mer频数升高下降至最低即产生了上升趋势。
                                                                                    • -
                                                                                  • 用KmerGenie软件做基因组调查时，可以根据每个k-mer值的频数分布图结果选择更为合适的k-mer值做基因组特征评估。
                                                                                    • +
                                                                                  • 重复序列的含量 = $$1 - b[1/2] - b[1]$$
                                                                                  -

                                                                                  7. references

                                                                                    -
                                                                                  1. KmerGenie website：http://kmergenie.bx.psu.edu/
                                                                                    2. -
                                                                                  2. KmerGenie paper：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/30/1/31/235479
                                                                                    3. -
                                                                                  3. http://blog.sciencenet.cn/blog-3406804-1159967.html
                                                                                    4. -
                                                                                  4. https://www.jianshu.com/p/0251b55977c0
                                                                                    5. +

                                                                                    5. references

                                                                                      +
                                                                                    1. GCE github：https://github.com/fanagislab/GCE
                                                                                      2. +
                                                                                    2. kmerfreq：https://github.com/fanagislab/kmerfreq
                                                                                      3. +
                                                                                    3. GCE paper：https://arxiv.org/abs/1308.2012
                                                                                      4. +
                                                                                    4. GCE blog：http://www.chenlianfu.com/?p=2335
                                                                                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                    • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                    - -]]> +]]> omics genome @@ -14450,7 +14454,8 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 genome survey genome k-mer - KmerGenie + GCE + kmerfreq @@ -15047,91 +15052,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 QualiMap - - 基因组质量评估：（五）mapping法：4. 观察mapped reads的深度分布 - /2022/07/27/omics_genome_quality.assessment_mapping_depth_observe/ - - -

                                                                                    1. 前情提要：mapping和depth

                                                                                    此篇博客在已经通过mapping获得SAM/BAM文件，且进行深度统计获得深度分布文件的基础上进行分析，

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 关于mapping获得SAM/BAM文件的操作可以参考博客：
                                                                                      2. -
                                                                                    -

                                                                                    基因组质量评估：（五）mapping法：1. 简介

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 关于通过SAM/BAM文件统计深度分布可以参考博客：
                                                                                      2. -
                                                                                    -

                                                                                    基因组质量评估：（五）mapping法：3. 统计mapped reads的深度分布

                                                                                    -

                                                                                    2. 深度分布

                                                                                      -
                                                                                    • 在测序是随机分布的情况下，期望在基因组的所有染色体上，mapped reads的depth是均匀分布的。
                                                                                      • -
                                                                                    • 把reads回mapping到组装好的基因组，通过计算depth，观察depth在基因组上的分布来判断组装的质量。
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    3. 评估对象

                                                                                    用clean reads映射（mapping）回组装好的初始基因组，然后查看mapping的效果。

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 如果是长度不长的细胞器基因组，或者核基因组的特定位置，可以在IGV直接查看mapping情况。
                                                                                      • -
                                                                                    • 如果是大的核基因组，则考虑过滤mapping得到的sam/bam文件，然后计算深度和其他统计值来评估质量。
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    4. 查看深度

                                                                                    4.1. 背景

                                                                                      -
                                                                                    1. 由于叶绿体基因组结构稳定，较少需要用这种方式评估组装质量；核基因组较大，肉眼观察不可实现，所以此方法多用于线粒体基因组组装质量和核基因组部分区域的评估。
                                                                                      2. -
                                                                                    2. 在核与细胞器同时测序情况下，由于数量分布差异，期望测序深度是叶绿体>线粒体>核基因，且三者差异是数量级级别的。
                                                                                      3. -
                                                                                    3. 评估线粒体基因组时，可以考虑是否有叶绿体/核的reads映射到基因组上，并同时考虑水平基因转移的可能性。
                                                                                      4. -
                                                                                    -

                                                                                    线粒体基因组的mapping注意事项

                                                                                      -
                                                                                    1. 如果担心叶绿体派生的reads影响重组率的计算，可以把叶绿体基因组和线粒体基因组一起做reference做mapping，这样叶绿体的reads会被mapping到叶绿体上，从而起到过滤叶绿体派生reads的作用。
                                                                                      2. -
                                                                                    2. 如果担心核基因派生的reads影响，可以用一个cutoff值(比如100bp)，小于100bp的mapping被筛除。同时在深度分布查看做进一步肉眼判断和筛除。
                                                                                      3. -
                                                                                    -

                                                                                    4.2. 深度分布的查看

                                                                                    ​可以在IGV等bam文件可视化的软件里直观地查看mapped reads的深度分布。

                                                                                    -

                                                                                    期望深度在全基因组范围保持相当，如果有极端高/低的深度，则怀疑组装错误，或者映射了错误的reads，反映了错误或者特定特征的mapped reads。

                                                                                    -
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                                                                                    1. 重复序列
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 如果基因组上存在重复序列，组装时只得到其中一个拷贝，则在这个拷贝处的mapped reads深度会是附近序列的两倍（三个拷贝就三倍）。
                                                                                      • -
                                                                                    • 重复序列一般只分析超过100bp(或者>50bp)的情况，这可以和核基因转移到线粒体的情况区别开。
                                                                                      • -
                                                                                    • 重复序列之间非常接近，但不一定是完美匹配。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 水平基因转移【线粒体】
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 显著高的深度可能是叶绿体的reads。
                                                                                      • -
                                                                                    • 显著低的深度可能是核的reads。
                                                                                      • -
                                                                                    • 轻微高的深度可能是核转移到线粒体的情况（一般这种情况映射到的序列不长，<100bp）。可以调整参数，只保留映射超过100bp的reads即可排除这种情况。
                                                                                      • -
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                                                                                      -
                                                                                    1. 异质性【线粒体】
                                                                                      由于一个细胞中有多个细胞器，细胞器之间还可能存在不同构象或不同碱基的位点。这种情况的存在称为细胞器的异质性（不常见）。
                                                                                      2. -
                                                                                    -

                                                                                    具有异质位点的细胞器基因组的证据：

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 排除重复序列映射的可能性。
                                                                                      • -
                                                                                    • 异质位点映射的reads包含两种（也可能多种，以下同）碱基，一般少数种的占比超过5%就可能算异质性了。
                                                                                      • -
                                                                                    • 异质位点映射的reads的两种碱基的深度加起来应该与周围位点的深度相当。
                                                                                      • -
                                                                                    • 异质位点映射的reads不全都很短（>100bp），双端测序的最好是成对映射。
                                                                                      • -
                                                                                    • 异质位点周围的位点映射了同一read，且周围位点的mapping效果很好（单一碱基，均匀深度）。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                      • -
                                                                                    • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                      • -
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                                                                                  5. depth_distribution.plot
                                                                                    -
                                                                                  • 示例：
                                                                                    • +
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                                                                                    • +
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                                                                                  2	376656	0.001470	254385018	0.992845
                                                                                  3	420120	0.001640	253964898	0.991206
                                                                                  4	471142	0.001839	253493756	0.989367
                                                                                  5	548760	0.002142	252944996	0.987225
                                                                                  + +
                                                                                    +
                                                                                  1. depth.tsv.gz
                                                                                    2. +
                                                                                  +

                                                                                  文件包含输入的sample.bed的每个位置的三种深度：

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • raw depth：没有过滤的从bam文件直接提取的深度。coverage.report文件是用raw depth统计得到的。
                                                                                    • +
                                                                                  • rmdup depth：过滤掉duplicated reads，secondary alignment reads，low map quality reads(mapQ<20)后计算的depth。开发者说类似samtools depth的结果，但应该是raw depth类似samtools depth，rmdup depth类似samtools mpileup才更准确。如果想用rmdup depth统计coverage.report，运行时加上参数“–use_rmdup”。
                                                                                    • +
                                                                                  • coverage depth：考虑deletion区域的raw depth，所以值会大于或等于raw depth的值。
                                                                                    • +
                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  1. region.tsv.gz
                                                                                    2. +
                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • 文件包含输入的sample.bed的每个区域的average depth，median depth，coverage。
                                                                                    • +
                                                                                  +

                                                                                  4. references

                                                                                    +
                                                                                  1. https://github.com/shiquan/bamdst
                                                                                    2. +
                                                                                  +
                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                    • +
                                                                                  • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                    • +
                                                                                  +]]> + + omics + genome + quality assessment + + + biosoft + genome + quality assessment + mapping + sam + bam + depth + bamdst + + + + 基因组质量评估：（五）mapping法：4. 观察mapped reads的深度分布 + /2022/07/27/omics_genome_quality.assessment_mapping_depth_observe/ + + +

                                                                                  1. 前情提要：mapping和depth

                                                                                  此篇博客在已经通过mapping获得SAM/BAM文件，且进行深度统计获得深度分布文件的基础上进行分析，

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  1. 关于mapping获得SAM/BAM文件的操作可以参考博客：
                                                                                    2. +
                                                                                  +

                                                                                  基因组质量评估：（五）mapping法：1. 简介

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  1. 关于通过SAM/BAM文件统计深度分布可以参考博客：
                                                                                    2. +
                                                                                  +

                                                                                  基因组质量评估：（五）mapping法：3. 统计mapped reads的深度分布

                                                                                  +

                                                                                  2. 深度分布

                                                                                    +
                                                                                  • 在测序是随机分布的情况下，期望在基因组的所有染色体上，mapped reads的depth是均匀分布的。
                                                                                    • +
                                                                                  • 把reads回mapping到组装好的基因组，通过计算depth，观察depth在基因组上的分布来判断组装的质量。
                                                                                    • +
                                                                                  +

                                                                                  3. 评估对象

                                                                                  用clean reads映射（mapping）回组装好的初始基因组，然后查看mapping的效果。

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • 如果是长度不长的细胞器基因组，或者核基因组的特定位置，可以在IGV直接查看mapping情况。
                                                                                    • +
                                                                                  • 如果是大的核基因组，则考虑过滤mapping得到的sam/bam文件，然后计算深度和其他统计值来评估质量。
                                                                                    • +
                                                                                  +

                                                                                  4. 查看深度

                                                                                  4.1. 背景

                                                                                    +
                                                                                  1. 由于叶绿体基因组结构稳定，较少需要用这种方式评估组装质量；核基因组较大，肉眼观察不可实现，所以此方法多用于线粒体基因组组装质量和核基因组部分区域的评估。
                                                                                    2. +
                                                                                  2. 在核与细胞器同时测序情况下，由于数量分布差异，期望测序深度是叶绿体>线粒体>核基因，且三者差异是数量级级别的。
                                                                                    3. +
                                                                                  3. 评估线粒体基因组时，可以考虑是否有叶绿体/核的reads映射到基因组上，并同时考虑水平基因转移的可能性。
                                                                                    4. +
                                                                                  +

                                                                                  线粒体基因组的mapping注意事项

                                                                                    +
                                                                                  1. 如果担心叶绿体派生的reads影响重组率的计算，可以把叶绿体基因组和线粒体基因组一起做reference做mapping，这样叶绿体的reads会被mapping到叶绿体上，从而起到过滤叶绿体派生reads的作用。
                                                                                    2. +
                                                                                  2. 如果担心核基因派生的reads影响，可以用一个cutoff值(比如100bp)，小于100bp的mapping被筛除。同时在深度分布查看做进一步肉眼判断和筛除。
                                                                                    3. +
                                                                                  +

                                                                                  4.2. 深度分布的查看

                                                                                  ​可以在IGV等bam文件可视化的软件里直观地查看mapped reads的深度分布。

                                                                                  +

                                                                                  期望深度在全基因组范围保持相当，如果有极端高/低的深度，则怀疑组装错误，或者映射了错误的reads，反映了错误或者特定特征的mapped reads。

                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  1. 重复序列
                                                                                    2. +
                                                                                  +
                                                                                    +
                                                                                  • 如果基因组上存在重复序列，组装时只得到其中一个拷贝，则在这个拷贝处的mapped reads深度会是附近序列的两倍（三个拷贝就三倍）。
                                                                                    • +
                                                                                  • 重复序列一般只分析超过100bp(或者>50bp)的情况，这可以和核基因转移到线粒体的情况区别开。
                                                                                    • +
                                                                                  • 重复序列之间非常接近，但不一定是完美匹配。
                                                                                  -
                                                                                  0	1080969	0.004219	255137234	0.995781
                                                                                  1	375560	0.001466	254761674	0.994315
                                                                                  2	376656	0.001470	254385018	0.992845
                                                                                  3	420120	0.001640	253964898	0.991206
                                                                                  4	471142	0.001839	253493756	0.989367
                                                                                  5	548760	0.002142	252944996	0.987225
                                                                                  - -
                                                                                    -
                                                                                  1. depth.tsv.gz
                                                                                    2. +
                                                                                      +
                                                                                    1. 水平基因转移【线粒体】
                                                                                    -

                                                                                    文件包含输入的sample.bed的每个位置的三种深度：

                                                                                      -
                                                                                    • raw depth：没有过滤的从bam文件直接提取的深度。coverage.report文件是用raw depth统计得到的。
                                                                                      • -
                                                                                    • rmdup depth：过滤掉duplicated reads，secondary alignment reads，low map quality reads(mapQ<20)后计算的depth。开发者说类似samtools depth的结果，但应该是raw depth类似samtools depth，rmdup depth类似samtools mpileup才更准确。如果想用rmdup depth统计coverage.report，运行时加上参数“–use_rmdup”。
                                                                                      • -
                                                                                    • coverage depth：考虑deletion区域的raw depth，所以值会大于或等于raw depth的值。
                                                                                      • +
                                                                                    • 显著高的深度可能是叶绿体的reads。
                                                                                      • +
                                                                                    • 显著低的深度可能是核的reads。
                                                                                      • +
                                                                                    • 轻微高的深度可能是核转移到线粒体的情况（一般这种情况映射到的序列不长，<100bp）。可以调整参数，只保留映射超过100bp的reads即可排除这种情况。
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. region.tsv.gz
                                                                                      2. +
                                                                                        +
                                                                                      1. 异质性【线粒体】
                                                                                        由于一个细胞中有多个细胞器，细胞器之间还可能存在不同构象或不同碱基的位点。这种情况的存在称为细胞器的异质性（不常见）。
                                                                                      +

                                                                                      具有异质位点的细胞器基因组的证据：

                                                                                        -
                                                                                      • 文件包含输入的sample.bed的每个区域的average depth，median depth，coverage。
                                                                                        • +
                                                                                      • 排除重复序列映射的可能性。
                                                                                        • +
                                                                                      • 异质位点映射的reads包含两种（也可能多种，以下同）碱基，一般少数种的占比超过5%就可能算异质性了。
                                                                                        • +
                                                                                      • 异质位点映射的reads的两种碱基的深度加起来应该与周围位点的深度相当。
                                                                                        • +
                                                                                      • 异质位点映射的reads不全都很短（>100bp），双端测序的最好是成对映射。
                                                                                        • +
                                                                                      • 异质位点周围的位点映射了同一read，且周围位点的mapping效果很好（单一碱基，均匀深度）。
                                                                                      -

                                                                                      4. references

                                                                                        -
                                                                                      1. https://github.com/shiquan/bamdst
                                                                                        2. -
                                                                                      • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                        • @@ -15233,14 +15236,16 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 quality assessment - biosoft + mitogenome genome + organelle + samtools quality assessment mapping sam bam depth - bamdst + plastome @@ -15963,7 +15968,7 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                                                      • SEQ_FEAT.TransLen
                                                                                        • 表示蛋白质长度与预测的蛋白质长度不匹配，运行错误
                                                                                          • -
                                                                                        • 建议重跑table2asn，报错持续存在就写邮件把sample.sqn和运行的命令行发给NCBI(genomes@ncbi.nlm.nih.gov)让帮忙修改这个错误。
                                                                                          • +
                                                                                        • 建议重跑table2asn，报错持续存在就写邮件把sample.sqn和运行的命令行发给NCBI(genomes@ncbi.nlm.nih.gov)让帮忙修改这个错误。
                                                                                      • SEQ_FEAT.BadInternalCharacter
                                                                                          @@ -16140,257 +16145,52 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                                                    • Eukaryotic and Prokaryotic Genomes(WGS or Complete): 组装好的真核和原核物种的基因组
                                                                                      • -
                                                                                    • Transcriptome Shotgun Assembly (TSA)：组装好的转录组
                                                                                      • -
                                                                                    • Unassembled sequence reads (SRA)：未组装的测序reads
                                                                                      • -
                                                                                    • Sequence data not listed above：mRNA, genomic DNA, organelle, ncRNA, plasmids…：其他测序数据，细胞器基因组选这个。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. Contact：填写上传人的信息，包括姓名，学院，学校，地址，城市，地区/省份，邮编，国家，和接收上传信息的邮箱【重要】。
                                                                                      2. -
                                                                                    2. Reference：填写提供序列的作者和出版信息。
                                                                                      3. -
                                                                                    3. Sequencing Technology：填写测序方法信息，包括测序平台，是否是组装的数据，组装软件和版本，组装样品名称，覆盖度。
                                                                                      4. -
                                                                                    4. Nucleotide：填写序列的信息。
                                                                                      5. -
                                                                                    -
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                                                                                    • 序列发布的时间，可以指定日期，也可以一通过上传审核就发布。
                                                                                      • -
                                                                                    • 分子类型（Molecule Type）：细胞器基因组选的genomic DNA
                                                                                      • -
                                                                                    • 拓扑结构（Topology）：线型分子（Linear）还是环形分子（Circular）。
                                                                                      • -
                                                                                    • 是否是完整的细胞器基因组：yes/no。
                                                                                      • -
                                                                                    • 核苷酸序列格式：fasta或者alignment，选的fasta
                                                                                      • -
                                                                                    • 上传细胞器基因组的fasta文件
                                                                                      • -
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                                                                                    1. Organism：填写Organism name信息，可填物种的学名。
                                                                                      2. -
                                                                                    2. Submission Category：测序reads是上传者测序的还是使用的其他已上传序列数据。如果是使用其他已上传reads进行的组装则需要提供已上传reads的accession number。
                                                                                      3. -
                                                                                    3. Source Modifiers：资源信息。
                                                                                      4. -
                                                                                    -
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                                                                                    • Organelle/Location: 叶绿体/线粒体/其他器官。
                                                                                      • -
                                                                                    • Source Modifier可以填写Country；对应的value填写China。
                                                                                      • -
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                                                                                      2. -
                                                                                    2. Review and Correct：回顾和确认填写的信息，即可完成提交。
                                                                                      3. -
                                                                                    -

                                                                                    没什么问题的话，两个工作日内会发邮件告知GenBank accession numbers，可用于文章引用。

                                                                                    -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                      • -
                                                                                    • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                      • -
                                                                                    -]]> - - omics - organelle - - - mitogenome - plastome - submit - - - - 线粒体的重复介导重组的鉴定和计算重组频率 - /2023/03/14/omics_organelle_recombination.frequency/ - - -

                                                                                    1. 线粒体的重复介导重组（repeat-mediated recombination）

                                                                                      -
                                                                                    1. 线粒体的重复序列
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 通常在植物线粒体上存在重复序列（这里的重复序列不是核基因组的TE等转座元件的概念，就是一段序列在另一个位置同时存在完全一致的序列），则有可能介导重组，从而生成线粒体的多种构象。重复序列常常成对存在（也有一些超过两个），被称作重复对（repeat pairs）。
                                                                                      • -
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                                                                                      2. -
                                                                                    -
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                                                                                    • Illumina PE测序是双端测序，测序获得的reads常见的长度是150bp。一对reads的联合体的长度被称为插入尺寸（insert size）。插入尺寸（insert size）常在350bp左右，但具体的每对测序reads都不一样，要通过把reads进行mapping到参考序列上，才能测量insert size。
                                                                                      • -
                                                                                    • 如果是repeat pairs的长度小于测序reads的insert size长度，可以构建两种构象（参考构象和重组构象），把reads mapping到两种构象来判断repeat pairs是否介导重组（如果两种构象都有mapped reads则是repeat pair介导重组的证据），并且通过mapped reads的计数来计算重组频率（recombination frequency）。
                                                                                      • -
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                                                                                    2.1. 鉴定重复的脚本

                                                                                    这篇文章Repeats of Unusual Size in Plant Mitochondrial Genomes: Identification, Incidence and Evolution： https://academic.oup.com/g3journal/article/9/2/549/6026745 总结了植物线粒体基因组的重复序列的特征。研究表明，植物线粒体基因组比动物的要大，包含大量的非编码DNA，突变率低，重排率高。

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 文章提供了python脚本ROUSFinder.py，用在鉴定线粒体的重复序列上。
                                                                                      • -
                                                                                    • 脚本是python2写的，依赖主要有blastn。
                                                                                      • -
                                                                                    • 有以下三个版本。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. ROUSFinder.py
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 调用blastn进行一条序列与自身的成对比对。
                                                                                      • -
                                                                                    • 默认参数是最小重复50bp，E value 10,000， match的赏分是+1，mismatch的罚分是-20。
                                                                                      • -
                                                                                    • 脚本贴在下面：
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    #! /usr/bin/env python  
                                                                                    import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                                    csv.field_size_limit(sys.maxsize)  
                                                                                      
                                                                                    # January 16, 2018 version 1.1  
                                                                                    # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                                    # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                                    # May be very slow with larger genomes.   
                                                                                    # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                                    # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                                    # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                                    # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                                    # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                                    # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                                    # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                                    # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                                    # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                                    # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                                    # Percent identity is limited to >=99%, to allow for sequencing errors of <1%.  
                                                                                    # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                                    # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                                    # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                                    #  
                                                                                    # PARAMETERS  
                                                                                    #   REQUIRED:  
                                                                                    #      input file in fasta format  
                                                                                    #   Optional  
                                                                                    #      -o output file name  
                                                                                    #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                                    #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                                    #      -k keep temp files  
                                                                                    #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                                      
                                                                                    parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                                    parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                                    parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                                    parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=24', default='24')  
                                                                                    parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                                    parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                                    parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                                    results = parser.parse_args()  
                                                                                    infile = results.infile  
                                                                                    outfile = results.outfile  
                                                                                    minlen = int(results.minlen)  
                                                                                    blast_path = results.blast_path  
                                                                                    keep = results.keep  
                                                                                    genbank = results.genbank  
                                                                                      
                                                                                    # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                                    # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                                    # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                                    wordsize = str(minlen)  
                                                                                      
                                                                                    # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                                    # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                                    if outfile == 'default':  
                                                                                        outfile = infile  
                                                                                        if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                            for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                                index = outfile.index('/')  
                                                                                                outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                        if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                            outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                        outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                                    outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                                    outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                                    outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                                    outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                                    outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                                    tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                                    temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                                    tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                      
                                                                                    # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                                    seq = open(infile, 'r')  
                                                                                    seqname = seq.readline()  
                                                                                    seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                                    seqname = seqname.rstrip()  
                                                                                    seqlen = 0   
                                                                                    for line in seq:  
                                                                                        if(line[0] == ">"):  
                                                                                            continue  
                                                                                        seqlen += len(line.strip())  
                                                                                    seq.close()  
                                                                                      
                                                                                    # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                                    print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                                    os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                                    os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                      
                                                                                    # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                                    # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                      
                                                                                    print 'Sorting alignments...'  
                                                                                    f = open(tempblast, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(f)  
                                                                                    alignments = list(reader)  
                                                                                    f.close()  
                                                                                    alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                                    alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                      
                                                                                    # New list of uniques  
                                                                                    # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                                    # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                                    # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                                    # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                                    # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                                    # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                                    print 'Finding unique repeats...'  
                                                                                    uniques = []  
                                                                                    sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                                    for row in range(len(alignments)):  
                                                                                        sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                        if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                            # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                            # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                            sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                            break  
                                                                                        else:  
                                                                                          
                                                                                            for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                                if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                                    uniques.append(alignments[row])  
                                                                                                    sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                                    break  
                                                                                                else:  
                                                                                                    sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                                    if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    else:  
                                                                                                        sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                      
                                                                                    sp.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write uniques into output file  
                                                                                    # Start list for copy number table  
                                                                                    rous_count = 0  
                                                                                    g = open(outfa, 'w')  
                                                                                    repcopies = []  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(uniques)):  
                                                                                        qstart = uniques[i][0]  
                                                                                        qend = uniques[i][1]  
                                                                                        length = uniques[i][2]  
                                                                                        seq = uniques[i][7]  
                                                                                          
                                                                                        rous_count += 1  
                                                                                        g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                        repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                              
                                                                                    if rous_count == 0:  
                                                                                        print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                                    g.close()  
                                                                                    print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                      
                                                                                    # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                                    # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                                    # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                      
                                                                                    print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                                    g = open(outfa, 'r')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp" > '+temprepeats)  
                                                                                    g.close()  
                                                                                      
                                                                                    tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(tempr)  
                                                                                    replist = list(reader)  
                                                                                    tempr.close()  
                                                                                      
                                                                                    print "Making a table of the repeats..."  
                                                                                    sum_rep_len = 0  
                                                                                    bin_dict = {}  
                                                                                    binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                      
                                                                                    # defining the bins  
                                                                                    i = 0  
                                                                                    j = 50  
                                                                                    while j < 1000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i += 1  
                                                                                        j += 50  
                                                                                    while j <= 10000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i +=1  
                                                                                        j += 250  
                                                                                          
                                                                                    # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                                    posit = []  
                                                                                    for n in range(seqlen):  
                                                                                        posit.append(0)  
                                                                                      
                                                                                    # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                                    # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                                    # make list for genbank file  
                                                                                    # Keep stats on lengths  
                                                                                    rt = open(outtab, 'w')  
                                                                                    rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n')  
                                                                                    templist = []  
                                                                                    gblist =[]  
                                                                                      
                                                                                    # look at each repeat in turn  
                                                                                    for i in range(len(replist)):  
                                                                                        # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                        if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                            rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\t'+str(replist[i][4])+'\n')  
                                                                                            if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                                location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                            else:  
                                                                                                location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                            gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                            templist.append(replist[i][0])  
                                                                                            # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                            # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                            # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                            for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                                posit[n] = 1  
                                                                                            # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                            # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                            for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                                if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                                    binned[j+3] +=1  
                                                                                                    break  
                                                                                    sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                                    binned[2] = sum_rep_len  
                                                                                    rt.close()  
                                                                                    if genbank == True:  
                                                                                        gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                        for i in range(len(gblist)):  
                                                                                            gb.write(gblist[i])  
                                                                                        gb.close()  
                                                                                      
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                                    # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                                    rc = open(outcount,'w')  
                                                                                    rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumRepeats\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                      
                                                                                    numrous = 0  
                                                                                    sizerous = 0  
                                                                                    copyrous = 0  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        repname = repcopies[i][0]  
                                                                                        replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                        repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                      
                                                                                        numrous += 1  
                                                                                        sizerous += replen  
                                                                                        copyrous += repcop  
                                                                                      
                                                                                    if numrous == 0:  
                                                                                        avsizerous = 'NA'  
                                                                                        avcopyrous = 'NA'  
                                                                                    else:  
                                                                                        avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                        avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                      
                                                                                      
                                                                                    rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    rc.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                                    binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                                    binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                                    for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                        binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    for i in range(len(binned)):  
                                                                                        binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    binfile.close()  
                                                                                    print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                      
                                                                                    # Removing temp files if necessary  
                                                                                    if keep == False:  
                                                                                        os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                      
                                                                                    # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                                    quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                                    import random, binascii  
                                                                                    z = random.randint(0,10)  
                                                                                    print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. MultipleRepeats.py
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • MultipleRepeats.py批量运行一个文件夹下的每个序列文件。
                                                                                      • -
                                                                                    • 脚本贴在下面：
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    #! /usr/bin/env python  
                                                                                    import sys, math, os, argparse  
                                                                                      
                                                                                    # Usage: -din directory of files to find repeats in  
                                                                                    #        -word word_size  
                                                                                      
                                                                                    parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a directory of fasta sequence files')  
                                                                                    parser.add_argument('-din', action='store', dest='din', help='Input .fasta directory')  
                                                                                    parser.add_argument('-word', action='store', dest='word', help='Word size for blast')  
                                                                                    results = parser.parse_args()  
                                                                                    din = results.din  
                                                                                    word = results.word  
                                                                                      
                                                                                    li = os.listdir(din)  
                                                                                    inputs = filter(lambda x: '.fasta' in x, li)  
                                                                                    inputs.sort()  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(inputs)):  
                                                                                        infile = str(inputs[i])  
                                                                                        os.system("/home/alan/applications/ROUSFinder.py -m "+word+" "+din+infile)
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. ROUSFinder2.py
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • ROUSFinder2.py可以在命令行设置match赏分和mismatch罚分。
                                                                                      • -
                                                                                    • 脚本贴在下面：
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    #! /usr/bin/env python  
                                                                                    import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                                    csv.field_size_limit(sys.maxsize)  
                                                                                      
                                                                                    # Version 2.0, November 21, 2018  
                                                                                    # Changes: uses variable parameters  
                                                                                    # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                                    # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                                    # May be very slow with larger genomes.   
                                                                                    # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                                    # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                                    # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                                    # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                                    # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                                    # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                                    # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                                    # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                                    # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                                    # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                                    # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                                    # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                                    # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                                    #  
                                                                                    # PARAMETERS  
                                                                                    #   REQUIRED:  
                                                                                    #      input file in fasta format  
                                                                                    #   Optional  
                                                                                    #      -o output file name  
                                                                                    #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                                    #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                                    #      -k keep temp files  
                                                                                    #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                                    #      -rew reward for match (default is 1)  
                                                                                    #      -pen penalty for mismatch (default is 20)  
                                                                                      
                                                                                    parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                                    parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                                    parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                                    parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=50', default='50')  
                                                                                    parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                                    parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                                    parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                                    parser.add_argument('-rew', action='store', dest='reward', help='Reward for match', default='1')  
                                                                                    parser.add_argument('-pen', action='store', dest='penalty', help='Penalty for mismatch', default='20')  
                                                                                    results = parser.parse_args()  
                                                                                    infile = results.infile  
                                                                                    outfile = results.outfile  
                                                                                    minlen = int(results.minlen)  
                                                                                    blast_path = results.blast_path  
                                                                                    keep = results.keep  
                                                                                    genbank = results.genbank  
                                                                                    reward = results.reward  
                                                                                    penalty = results.penalty  
                                                                                      
                                                                                    # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                                    # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                                    # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                                    wordsize = str(minlen)  
                                                                                      
                                                                                    # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                                    # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                                    if outfile == 'default':  
                                                                                        outfile = infile  
                                                                                        if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                            for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                                index = outfile.index('/')  
                                                                                                outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                        if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                            outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                        outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                                    outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                                    outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                                    outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                                    outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                                    outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                                    tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                                    temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                                    tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                      
                                                                                    # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                                    seq = open(infile, 'r')  
                                                                                    seqname = seq.readline()  
                                                                                    seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                                    seqname = seqname.rstrip()  
                                                                                    seqlen = 0   
                                                                                    for line in seq:  
                                                                                        if(line[0] == ">"):  
                                                                                            continue  
                                                                                        seqlen += len(line.strip())  
                                                                                    seq.close()  
                                                                                      
                                                                                    # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                                    print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname      
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10  -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                                    os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                                    os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                      
                                                                                    # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                                    # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                      
                                                                                    print 'Sorting alignments...'  
                                                                                    f = open(tempblast, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(f)  
                                                                                    alignments = list(reader)  
                                                                                    f.close()  
                                                                                    alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                                    alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                      
                                                                                    # New list of uniques  
                                                                                    # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                                    # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                                    # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                                    # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                                    # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                                    # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                                    print 'Finding unique repeats...'  
                                                                                    uniques = []  
                                                                                    sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                                    for row in range(len(alignments)):  
                                                                                        sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                        if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                            # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                            # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                            sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                            break  
                                                                                        else:  
                                                                                          
                                                                                            for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                                if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                                    uniques.append(alignments[row])  
                                                                                                    sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                                    break  
                                                                                                else:  
                                                                                                    sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                                    if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    else:  
                                                                                                        sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                      
                                                                                    sp.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write uniques into output file  
                                                                                    # Start list for copy number table  
                                                                                    rous_count = 0  
                                                                                    g = open(outfa, 'w')  
                                                                                    repcopies = []  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(uniques)):  
                                                                                        qstart = uniques[i][0]  
                                                                                        qend = uniques[i][1]  
                                                                                        length = uniques[i][2]  
                                                                                        seq = uniques[i][7]  
                                                                                          
                                                                                        rous_count += 1  
                                                                                        g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                        repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                              
                                                                                    if rous_count == 0:  
                                                                                        print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                                    g.close()  
                                                                                    print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                      
                                                                                    # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                                    # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                                    # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                      
                                                                                    print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                                    g = open(outfa, 'r')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp" > '+temprepeats)  
                                                                                    g.close()  
                                                                                      
                                                                                    tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(tempr)  
                                                                                    replist = list(reader)  
                                                                                    tempr.close()  
                                                                                      
                                                                                    print "Making a table of the repeats..."  
                                                                                    sum_rep_len = 0  
                                                                                    bin_dict = {}  
                                                                                    binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                      
                                                                                    # defining the bins  
                                                                                    i = 0  
                                                                                    j = 50  
                                                                                    while j < 1000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i += 1  
                                                                                        j += 50  
                                                                                    while j <= 10000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i +=1  
                                                                                        j += 250  
                                                                                          
                                                                                    # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                                    posit = []  
                                                                                    for n in range(seqlen):  
                                                                                        posit.append(0)  
                                                                                      
                                                                                    # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                                    # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                                    # make list for genbank file  
                                                                                    # Keep stats on lengths  
                                                                                    rt = open(outtab, 'w')  
                                                                                    rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n')  
                                                                                    templist = []  
                                                                                    gblist =[]  
                                                                                      
                                                                                    # look at each repeat in turn  
                                                                                    for i in range(len(replist)):  
                                                                                        # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                        if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                            rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\t'+str(replist[i][4])+'\n')  
                                                                                            if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                                location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                            else:  
                                                                                                location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                            gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                            templist.append(replist[i][0])  
                                                                                            # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                            # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                            # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                            for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                                posit[n] = 1  
                                                                                            # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                            # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                            for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                                if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                                    binned[j+3] +=1  
                                                                                                    break  
                                                                                    sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                                    binned[2] = sum_rep_len  
                                                                                    rt.close()  
                                                                                    if genbank == True:  
                                                                                        gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                        for i in range(len(gblist)):  
                                                                                            gb.write(gblist[i])  
                                                                                        gb.close()  
                                                                                      
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                                    # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                                    rc = open(outcount,'w')  
                                                                                    rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumROUS\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                      
                                                                                    numrous = 0  
                                                                                    sizerous = 0  
                                                                                    copyrous = 0  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        repname = repcopies[i][0]  
                                                                                        replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                        repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                      
                                                                                        numrous += 1  
                                                                                        sizerous += replen  
                                                                                        copyrous += repcop  
                                                                                      
                                                                                    if numrous == 0:  
                                                                                        avsizerous = 'NA'  
                                                                                        avcopyrous = 'NA'  
                                                                                    else:  
                                                                                        avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                        avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                      
                                                                                      
                                                                                    rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    rc.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                                    binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                                    binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                                    for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                        binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    for i in range(len(binned)):  
                                                                                        binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    binfile.close()  
                                                                                    print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                      
                                                                                    # Removing temp files if necessary  
                                                                                    if keep == False:  
                                                                                        os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                      
                                                                                    # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                                    quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                                    import random, binascii  
                                                                                    z = random.randint(0,10)  
                                                                                    print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                                    - -

                                                                                    2.2. 运行脚本鉴定重复

                                                                                    选择ROUSFinder2.py脚本来鉴定线粒体的重复序列。

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 脚本参数
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 必需参数：fasta格式的输入序列
                                                                                      • -
                                                                                    • -o out：输出文件名称
                                                                                      • -
                                                                                    • -m 50：鉴定的重复序列的最小长度，默认是50bp。
                                                                                      • -
                                                                                    • -b /path/to/blastn/：blastn命令的路径，默认是/usr/bin/。
                                                                                      • -
                                                                                    • -k：保留临时文件，out_tempblast.txt和out_temprepeats.txt
                                                                                      • -
                                                                                    • -gb：生成重复序列的genbank格式文件，out_repeats.gb.txt
                                                                                      • -
                                                                                    • -rew 1：match赏分，默认是+1
                                                                                      • -
                                                                                    • -pen 20：mismatch罚分，默认是-20
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 运行脚本
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • ROUSFinder2.py input.fa -m 30 -gb -o out
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    2.3. 结果文件

                                                                                      -
                                                                                    1. out_rep_table.txt：包含每个repeat单元的名称，长度，起始位置和终止位置，正负链（plus或minus）。
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 第一行显示了第一个染色体的名称和长度。
                                                                                      • -
                                                                                    • 后面的行有五列，分别是repeat名称，repeat长度，repeat在染色体序列上的起始位置和终止位置，repeat的正负链方向。
                                                                                      • -
                                                                                    • 通常前面只有一行信息的重复单元（如Repeat_1和Repeat_2）需要手动去除，留下后面有2个或以上重复单元的信息（如Repeat_3和Repeat_4）作为重复序列鉴定的结果。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    Chr01	147501
                                                                                    Repeat_1	2702	1	2702	plus
                                                                                    Repeat_2	2480	1	2480	plus
                                                                                    Repeat_3	1171	1933	3103	plus
                                                                                    Repeat_3	1171	2322	3492	plus
                                                                                    Repeat_4	938	1696	2633	plus
                                                                                    Repeat_4	938	2237	3174	plus
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. out_rep.fasta：包含fasta格式的repeat序列
                                                                                      2. -
                                                                                    2. out_rep_counts.txt：包含repeat的总数（NumROUS），平均长度（AvgSize），平均数量（AvgCopyNum），和每个repeat的长度和数量。
                                                                                      3. -
                                                                                    3. out_repeats.gb.txt：使用-gb参数则生成此文件，是genbank格式的repeat的注释文件。
                                                                                      4. -
                                                                                    4. out_binned.txt：包含>50bp,100bp,150bp,…,1000bp,1250bp,1500bp,…,10000bp的repeat的数量
                                                                                      5. -
                                                                                    5. out_tempblast.txt：使用-k参数会保留两个临时temp文件
                                                                                      6. -
                                                                                    6. out_temprepeats.txt：使用-k参数会保留两个临时temp文件。
                                                                                      7. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • out_temprepeats.txt是用重复单元与输入序列做blastn的-outfmt 10的结果，包含qseqid length sstart send sstrand qcovhsp六列内容。
                                                                                      • -
                                                                                    • out_rep_table.txt结果文件是从这个out_temprepeats.txt临时文件中提取生成的。
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    2.4. 修改鉴定重复的脚本，使其显示重复序列所在染色体位置

                                                                                    ROUSFinder2.py脚本鉴定线粒体的重复序列是被设计的用于鉴定一条序列与自身的重复，所以结果文件中不包含重复所在染色体位置信息。好在脚本容易修改，就修改了脚本使其显示染色体位置，可用于多染色体线粒体基因组的重复序列鉴定。

                                                                                    -

                                                                                    使用修改后脚本的输出结果中两个文件（out_rep_table.txt和out_temprepeats.txt）有所不同，其他结果文件都与修改前的脚本的结果一致。

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 修改后的脚本ROUSFinder2.0_adjusted.by.yz.py
                                                                                      2. -
                                                                                    - -
                                                                                    #! /usr/bin/env python  
                                                                                    import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                                    csv.field_size_limit(sys.maxsize)  

                                                                                    # minior adjustments by Yan Zhong, November 27, 2023  
                                                                                    # Version 2.0, November 21, 2018  
                                                                                    # Changes: uses variable parameters  
                                                                                    # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                                    # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                                    # May be very slow with larger genomes.   
                                                                                    # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                                    # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                                    # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                                    # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                                    # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                                    # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                                    # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                                    # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                                    # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                                    # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                                    # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                                    # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                                    # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                                    #  
                                                                                    # PARAMETERS  
                                                                                    #   REQUIRED:  
                                                                                    #      input file in fasta format  
                                                                                    #   Optional  
                                                                                    #      -o output file name  
                                                                                    #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                                    #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                                    #      -k keep temp files  
                                                                                    #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                                    #      -rew reward for match (default is 1)  
                                                                                    #      -pen penalty for mismatch (default is 20)  
                                                                                      
                                                                                    parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                                    parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                                    parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                                    parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=50', default='50')  
                                                                                    parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                                    parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                                    parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                                    parser.add_argument('-rew', action='store', dest='reward', help='Reward for match', default='1')  
                                                                                    parser.add_argument('-pen', action='store', dest='penalty', help='Penalty for mismatch', default='20')  
                                                                                    results = parser.parse_args()  
                                                                                    infile = results.infile  
                                                                                    outfile = results.outfile  
                                                                                    minlen = int(results.minlen)  
                                                                                    blast_path = results.blast_path  
                                                                                    keep = results.keep  
                                                                                    genbank = results.genbank  
                                                                                    reward = results.reward  
                                                                                    penalty = results.penalty  
                                                                                      
                                                                                    # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                                    # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                                    # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                                    wordsize = str(minlen)  
                                                                                      
                                                                                    # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                                    # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                                    if outfile == 'default':  
                                                                                        outfile = infile  
                                                                                        if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                            for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                                index = outfile.index('/')  
                                                                                                outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                        if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                            outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                        outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                                    outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                                    outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                                    outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                                    outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                                    outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                                    tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                                    temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                                    tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                      
                                                                                    # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                                    seq = open(infile, 'r')  
                                                                                    seqname = seq.readline()  
                                                                                    seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                                    seqname = seqname.rstrip()  
                                                                                    seqlen = 0   
                                                                                    for line in seq:  
                                                                                        if(line[0] == ">"):  
                                                                                            continue  
                                                                                        seqlen += len(line.strip())  
                                                                                    seq.close()  
                                                                                      
                                                                                    # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                                    print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname      
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10  -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                                    os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                                    os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                      
                                                                                    # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                                    # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                      
                                                                                    print 'Sorting alignments...'  
                                                                                    f = open(tempblast, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(f)  
                                                                                    alignments = list(reader)  
                                                                                    f.close()  
                                                                                    alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                                    alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                      
                                                                                    # New list of uniques  
                                                                                    # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                                    # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                                    # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                                    # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                                    # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                                    # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                                    print 'Finding unique repeats...'  
                                                                                    uniques = []  
                                                                                    sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                                    for row in range(len(alignments)):  
                                                                                        sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                        if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                            # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                            # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                            sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                            break  
                                                                                        else:  
                                                                                          
                                                                                            for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                                if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                                    uniques.append(alignments[row])  
                                                                                                    sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                                    break  
                                                                                                else:  
                                                                                                    sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                          
                                                                                                    if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                        sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                        break  
                                                                                                    else:  
                                                                                                        sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                      
                                                                                    sp.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write uniques into output file  
                                                                                    # Start list for copy number table  
                                                                                    rous_count = 0  
                                                                                    g = open(outfa, 'w')  
                                                                                    repcopies = []  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(uniques)):  
                                                                                        qstart = uniques[i][0]  
                                                                                        qend = uniques[i][1]  
                                                                                        length = uniques[i][2]  
                                                                                        seq = uniques[i][7]  
                                                                                          
                                                                                        rous_count += 1  
                                                                                        g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                        repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                              
                                                                                    if rous_count == 0:  
                                                                                        print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                                    g.close()  
                                                                                    print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                      
                                                                                    # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                                    # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                                    # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                      
                                                                                    print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                                    g = open(outfa, 'r')  
                                                                                    os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp sseqid qstart qend" > '+temprepeats)  # adjusted by yz
                                                                                    g.close()  
                                                                                      
                                                                                    tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                                    reader = csv.reader(tempr)  
                                                                                    replist = list(reader)  
                                                                                    tempr.close()  
                                                                                      
                                                                                    print "Making a table of the repeats..."  
                                                                                    sum_rep_len = 0  
                                                                                    bin_dict = {}  
                                                                                    binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                      
                                                                                    # defining the bins  
                                                                                    i = 0  
                                                                                    j = 50  
                                                                                    while j < 1000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i += 1  
                                                                                        j += 50  
                                                                                    while j <= 10000:  
                                                                                        bin_dict[i] = j  
                                                                                        binned.append(0)  
                                                                                        i +=1  
                                                                                        j += 250  
                                                                                          
                                                                                    # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                                    posit = []  
                                                                                    for n in range(seqlen):  
                                                                                        posit.append(0)  
                                                                                      
                                                                                    # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                                    # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                                    # make list for genbank file  
                                                                                    # Keep stats on lengths  
                                                                                    rt = open(outtab, 'w')  
                                                                                    # rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n') # adjusted by yz
                                                                                    rt.write('repeat.name'+'\t'+'alignment.length'+'\t'+'repeat.start'+'\t'+'repeat.end'+'\t'+'strand'+'\t'+'qcovhsp'+'\t'+'chr.name'+'\t'+'chr.start'+'\t'+'chr.end'+'\n')  # adjusted by yz
                                                                                    templist = []  
                                                                                    gblist =[]  
                                                                                      
                                                                                    # look at each repeat in turn  
                                                                                    for i in range(len(replist)):  
                                                                                        # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                        if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                            rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][7])+'\t'+str(replist[i][8])+'\t'+str(replist[i][4])+'\t'+str(replist[i][5])+'\t'+str(replist[i][6])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\n')  # adjusted by yz
                                                                                            if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                                location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                            else:  
                                                                                                location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                            gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                            templist.append(replist[i][0])  
                                                                                            # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                            # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                            # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                            for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                                posit[n] = 1  
                                                                                            # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                            # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                            for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                                if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                                    binned[j+3] +=1  
                                                                                                    break  
                                                                                    sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                                    binned[2] = sum_rep_len  
                                                                                    rt.close()  
                                                                                    if genbank == True:  
                                                                                        gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                        for i in range(len(gblist)):  
                                                                                            gb.write(gblist[i])  
                                                                                        gb.close()  
                                                                                      
                                                                                    # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                                    # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                                    rc = open(outcount,'w')  
                                                                                    rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumROUS\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                      
                                                                                    numrous = 0  
                                                                                    sizerous = 0  
                                                                                    copyrous = 0  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        repname = repcopies[i][0]  
                                                                                        replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                        repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                      
                                                                                        numrous += 1  
                                                                                        sizerous += replen  
                                                                                        copyrous += repcop  
                                                                                      
                                                                                    if numrous == 0:  
                                                                                        avsizerous = 'NA'  
                                                                                        avcopyrous = 'NA'  
                                                                                    else:  
                                                                                        avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                        avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                      
                                                                                      
                                                                                    rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                        rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                      
                                                                                    rc.close()  
                                                                                      
                                                                                    # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                                    binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                                    binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                                    for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                        binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    for i in range(len(binned)):  
                                                                                        binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                                    binfile.write('\n')  
                                                                                    binfile.close()  
                                                                                    print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                      
                                                                                    # Removing temp files if necessary  
                                                                                    if keep == False:  
                                                                                        os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                      
                                                                                    # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                                    quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                                    import random, binascii  
                                                                                    z = random.randint(0,10)  
                                                                                    print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. 修改前脚本的结果文件out_rep_table.txt
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 第一行显示了第一个染色体的名称和长度。
                                                                                      • -
                                                                                    • 后面的行有五列，分别是重复单元的名称(repeat.name)，重复单元的长度(alignment.length)，重复单元在输入的染色体序列上的起始位置和终止位置(chr.start和chr.end)，重复单元的正负链方向(strand)。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    Chr01	147501
                                                                                    Repeat_1	2702	1	2702	plus
                                                                                    Repeat_2	2480	1	2480	plus
                                                                                    Repeat_3	1171	1933	3103	plus
                                                                                    Repeat_3	1171	2322	3492	plus
                                                                                    Repeat_4	938	1696	2633	plus
                                                                                    Repeat_4	938	2237	3174	plus
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. 修改后脚本的结果文件out_rep_table.txt
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 添加了标题行。包含重复单元的名称(repeat.name)，重复单元的长度(alignment.length)，重复单元在重复序列上起始和终止位置(repeat.start和repeat.end)，重复单元的正负链方向(strand)，每个高度相似片段HSP中的重复单元的覆盖度(Query Coverage Per HSP, qcovhsp)，染色体序列名称(chr.name)，重复单元在输入的染色体序列上的起始位置和终止位置(chr.start和chr.end)。
                                                                                      • -
                                                                                    • 添加了列的展示，主要是染色体序列名称(chr.name)，还包括repeat.start和repeat.end，qcovhsp。
                                                                                      • -
                                                                                    • 调整了列的展示顺序。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                    repeat.name	alignment.length	repeat.start	repeat.end	strand	qcovhsp	chr.name	chr.start	chr.end
                                                                                    Repeat_1	2702	1	2702	plus	100	Chr38	1	2702
                                                                                    Repeat_2	2480	1	2480	plus	100	Chr39	1	2480
                                                                                    Repeat_3	1171	1	1171	plus	100	Chr34	1933	3103
                                                                                    Repeat_3	1171	1	1171	plus	100	Chr09	2322	3492
                                                                                    Repeat_4	938	1	938	plus	100	Chr38	1696	2633
                                                                                    Repeat_4	938	1	938	plus	100	Chr32	2237	3174
                                                                                    - -
                                                                                      -
                                                                                    1. 修改后脚本的结果文件out_temprepeats.txt
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 修改后脚本的结果文件out_temprepeats.txt比起修改前在后面多加了三列信息chr.name,repeat.start和repeat.end。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. notes（与脚本的修改无关）
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 从修改后脚本的结果文件out_rep_table.txt的示例文件可看出，qcovhsp列绝大部分情况下是100，因为这个值高于98才会被鉴定为重复单元。
                                                                                      • -
                                                                                    • repeat.start和repeat.end两列的值也一般是固定的，从1到重复单元的末位。这两列值是用重复序列与输入序列做blast，比对结果中比对到的重复序列的重复单元的位置，通常只有完全比对上（repeat.start和repeat.end两列值从1到重复单元的末位）的才被鉴定为重复单元。
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    2.5. 重复的应用

                                                                                      -
                                                                                    1. 辅助线粒体组装
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 通过鉴定出来的重复，可以帮助线粒体组装得更完整。
                                                                                      • -
                                                                                    • 调整线粒体的已有组装。比如通过计算重组率，把主导的优势构象作为最后的线粒体组装构象。
                                                                                      • -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 鉴定重组
                                                                                      2. -
                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    • 重复序列可能介导重组，所以鉴定重复是鉴定重组的基础。
                                                                                      • -
                                                                                    -

                                                                                    3. 鉴定重组和计算重组率

                                                                                    鉴定出线粒体的重复序列后，还可以进一步鉴定这些重复序列是否介导了重组。

                                                                                    -

                                                                                    重组会导致构象的变化，构象变化的形式包括：

                                                                                    -
                                                                                      -
                                                                                    1. 位于不同染色体环上的一对重复序列可能介导重组，使得两个小环变成一个大环。
                                                                                      2. -
                                                                                    2. 位于同一个染色体环上的同方向的一对重复序列可能介导重组，使得一个大环变成两个小环。
                                                                                      3. -
                                                                                    3. 位于同一个染色体环上的反方向的一对重复序列，可能在其他重复对的重组变换下变成同方向或者两个小环的状态。
                                                                                      4. -
                                                                                    -

                                                                                    3.1. 鉴定重组的步骤

                                                                                    3.1.1. 构建参考构象和重组构象的序列

                                                                                      -
                                                                                    1. 针对一对可能造成重组的重复序列，构建参考构象和重组构象
                                                                                      2. -
                                                                                    2. 在参考构象和重组构象中，以重复序列加上两翼各300bp作为参考构象序列(ref_1和ref_2)和重组构象序列(rec_1和rec_2)
                                                                                      3. -
                                                                                    3. 构建参考序列和mapping注意事项
                                                                                      4. +
                                                                                    4. Transcriptome Shotgun Assembly (TSA)：组装好的转录组
                                                                                      5. +
                                                                                    5. Unassembled sequence reads (SRA)：未组装的测序reads
                                                                                      6. +
                                                                                    6. Sequence data not listed above：mRNA, genomic DNA, organelle, ncRNA, plasmids…：其他测序数据，细胞器基因组选这个。
                                                                                      7. +
                                                                          +
                                                                            +
                                                                          1. Contact：填写上传人的信息，包括姓名，学院，学校，地址，城市，地区/省份，邮编，国家，和接收上传信息的邮箱【重要】。
                                                                            2. +
                                                                          2. Reference：填写提供序列的作者和出版信息。
                                                                            3. +
                                                                          3. Sequencing Technology：填写测序方法信息，包括测序平台，是否是组装的数据，组装软件和版本，组装样品名称，覆盖度。
                                                                            4. +
                                                                          4. Nucleotide：填写序列的信息。
                                                                            -
                                                                          • 可以把参考构象序列和重组构象序列（一共四条）一同作为参考序列（reference）用于mapping，避免同一条reads mapping到多个构象序列从而重复计数的情况。
                                                                            • -
                                                                          • 如果担心叶绿体派生的reads影响重组率的计算，还可以加上叶绿体基因组作为参考序列（reference），这样叶绿体的reads会被mapping到叶绿体上，从而起到过滤的作用。
                                                                            • -
                                                                          • 如果担心核基因派生的reads影响，可以用一个cutoff值(比如100bp)，小于100bp的mapping被筛除。
                                                                            • +
                                                                          • 序列发布的时间，可以指定日期，也可以一通过上传审核就发布。
                                                                            • +
                                                                          • 分子类型（Molecule Type）：细胞器基因组选的genomic DNA
                                                                            • +
                                                                          • 拓扑结构（Topology）：线型分子（Linear）还是环形分子（Circular）。
                                                                            • +
                                                                          • 是否是完整的细胞器基因组：yes/no。
                                                                            • +
                                                                          • 核苷酸序列格式：fasta或者alignment，选的fasta
                                                                            • +
                                                                          • 上传细胞器基因组的fasta文件
                                                                          -

                                                                          3.1.2. 把reads往参考序列进行mapping

                                                                            -
                                                                          1. 把reads往参考序列进行mapping，之后再根据mapping的reads的位置进行筛选，筛选出横跨repeat区域的有效mapping。
                                                                            2. -
                                                                          2. 比如repeat长度为220bp，两边各截取300bp，共820bp长度的参考序列。这里把跨越220bp的repeat，并且两边各至少映射上10bp的reads作为有效mapping。这意味着，mapping的起始位置需要小于290，终止位置需要大于530bp。
                                                                            3. -
                                                                          3. bwa进行mapping后得到的bam文件的第4列代表read比对到的参考序列最左侧的位置坐标（未必对上第4列为0）；第9列代表pair read完全匹配到同一条参考序列时，两个read之间的长度。可以理解为insert size。
                                                                            4. -
                                                                          -
                                                                          a = 530 # 设置终止位置需要大于的值，这里是530bp
                                                                          bwa index reference.fa # 为参考序列建立索引
                                                                          bwa mem -t 4 reference.fa  sample_1.clean.fq sample_2.clean.fq | samtools sort -@ 4 -m 4G > reference.bam # 映射reads到参考序列
                                                                          samtools view reference.bam |awk -F"\t" -v awka="$a" '$4<290 && ($4+$9)>awka {print $0}' > reference.bam.filter # 筛选起始位置小于290，终止位置大于530bp的mapped reads。这里的`awk -F"\t"`参数设定列分隔符非常重要，已经坑过我两把了。
                                                                          - -

                                                                          3.1.3. 计算重组率(recombination rate)

                                                                            -
                                                                          1. 把reads往参考序列进行mapping得到有效映射的比对文件reference.bam.filter后，计算不同参考序列的有效映射的reads数量（即数据行数）。
                                                                            2. -
                                                                          2. 重组构象的两条序列(rec_1和rec_2)的比对reads数量之和作为分子，重组构象的两条序列(rec_1和rec_2)的比对reads数量与参考构象的两条序列(ref_1和ref_2)的比对reads数量之和作为分母，两者的比值可作为重组率。
                                                                            3. +
                                                                              +
                                                                            1. Organism：填写Organism name信息，可填物种的学名。
                                                                              2. +
                                                                            2. Submission Category：测序reads是上传者测序的还是使用的其他已上传序列数据。如果是使用其他已上传reads进行的组装则需要提供已上传reads的accession number。
                                                                              3. +
                                                                            3. Source Modifiers：资源信息。
                                                                            -
                                                                            n_ref_1 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "ref_1" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列ref_1上有效映射reads的数量
                                                                            n_ref_2 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "ref_2" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列ref_2上有效映射reads的数量
                                                                            n_rec_1 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "rec_1" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列rec_1上有效映射reads的数量
                                                                            n_rec_2 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "rec_2" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列rec_2上有效映射reads的数量
                                                                            mapping_rate = $(($n_rec_1+$n_rec_2)/($n_ref_1+$n_ref_2+$n_rec_1+$n_rec_2)) # 计算重组率
                                                                            - -

                                                                            4. references

                                                                              -
                                                                            1. ROUSFinder.py脚本：https://academic.oup.com/g3journal/article/9/2/549/6026745
                                                                              2. +
                                                                                +
                                                                              • Organelle/Location: 叶绿体/线粒体/其他器官。
                                                                                • +
                                                                              • Source Modifier可以填写Country；对应的value填写China。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. Features：提供注释信息，可以选择tbl文件或者手动填写注释表格，tbl文件的ID和提交的序列ID需要一致。
                                                                                2. +
                                                                              2. Review and Correct：回顾和确认填写的信息，即可完成提交。
                                                                              +

                                                                              没什么问题的话，两个工作日内会发邮件告知GenBank accession numbers，可用于文章引用。

                                                                              • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                              • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                              -]]> +]]> omics organelle - recombination mitogenome - repeat - recombination - rearrangement - insert size - recombination frequency - ROUSFinder + plastome + submit @@ -16572,39 +16372,244 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有
                                                                            2. GIREMI 0.2.1
                                                                              https://github.com/zhqingit/giremi
                                                                            3. Varsim 0.5.1
                                                                              https://github.com/bioinform/varsim
                                                                            -

                                                                            4.9. 基因融合

                                                                              -
                                                                            1. FusionCatcher 0.99.5a beta
                                                                              https://github.com/ndaniel/fusioncatcher
                                                                              2. -
                                                                            2. JAFFA 1.0.6
                                                                              https://github.com/Oshlack/JAFFA
                                                                              3. -
                                                                            3. SOAPfuse 1.27
                                                                              http://soap.genomics.org.cn/soapfuse.html
                                                                              4. -
                                                                            4. STAR-Fusion 0.7.0
                                                                              https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion
                                                                              5. -
                                                                            5. TopHat-Fusion 2.0.14
                                                                              http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml
                                                                              s
                                                                              6. +

                                                                              4.9. 基因融合

                                                                                +
                                                                              1. FusionCatcher 0.99.5a beta
                                                                                https://github.com/ndaniel/fusioncatcher
                                                                                2. +
                                                                              2. JAFFA 1.0.6
                                                                                https://github.com/Oshlack/JAFFA
                                                                                3. +
                                                                              3. SOAPfuse 1.27
                                                                                http://soap.genomics.org.cn/soapfuse.html
                                                                                4. +
                                                                              4. STAR-Fusion 0.7.0
                                                                                https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion
                                                                                5. +
                                                                              5. TopHat-Fusion 2.0.14
                                                                                http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml
                                                                                s
                                                                                6. +
                                                                              +

                                                                              5. references

                                                                                +
                                                                              1. paper：https://www.nature.com/articles/s41467-017-00050-4
                                                                                2. +
                                                                              2. https://mp.weixin.qq.com/s/hp_wxiLDI9EVB8Z3L1bxbw
                                                                                3. +
                                                                              3. https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9959008.html
                                                                                4. +
                                                                              +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                • +
                                                                              • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                • +
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                                                                              1. 线粒体的重复介导重组（repeat-mediated recombination）

                                                                                +
                                                                              1. 线粒体的重复序列
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 通常在植物线粒体上存在重复序列（这里的重复序列不是核基因组的TE等转座元件的概念，就是一段序列在另一个位置同时存在完全一致的序列），则有可能介导重组，从而生成线粒体的多种构象。重复序列常常成对存在（也有一些超过两个），被称作重复对（repeat pairs）。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 鉴定的背景
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • Illumina PE测序是双端测序，测序获得的reads常见的长度是150bp。一对reads的联合体的长度被称为插入尺寸（insert size）。插入尺寸（insert size）常在350bp左右，但具体的每对测序reads都不一样，要通过把reads进行mapping到参考序列上，才能测量insert size。
                                                                                • +
                                                                              • 如果是repeat pairs的长度小于测序reads的insert size长度，可以构建两种构象（参考构象和重组构象），把reads mapping到两种构象来判断repeat pairs是否介导重组（如果两种构象都有mapped reads则是repeat pair介导重组的证据），并且通过mapped reads的计数来计算重组频率（recombination frequency）。
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              2. 鉴定重复

                                                                              2.1. 鉴定重复的脚本

                                                                              这篇文章Repeats of Unusual Size in Plant Mitochondrial Genomes: Identification, Incidence and Evolution： https://academic.oup.com/g3journal/article/9/2/549/6026745 总结了植物线粒体基因组的重复序列的特征。研究表明，植物线粒体基因组比动物的要大，包含大量的非编码DNA，突变率低，重排率高。

                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 文章提供了python脚本ROUSFinder.py，用在鉴定线粒体的重复序列上。
                                                                                • +
                                                                              • 脚本是python2写的，依赖主要有blastn。
                                                                                • +
                                                                              • 有以下三个版本。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. ROUSFinder.py
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 调用blastn进行一条序列与自身的成对比对。
                                                                                • +
                                                                              • 默认参数是最小重复50bp，E value 10,000， match的赏分是+1，mismatch的罚分是-20。
                                                                                • +
                                                                              • 脚本贴在下面：
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              #! /usr/bin/env python  
                                                                              import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                              csv.field_size_limit(sys.maxsize)  
                                                                                
                                                                              # January 16, 2018 version 1.1  
                                                                              # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                              # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                              # May be very slow with larger genomes.   
                                                                              # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                              # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                              # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                              # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                              # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                              # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                              # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                              # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                              # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                              # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                              # Percent identity is limited to >=99%, to allow for sequencing errors of <1%.  
                                                                              # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                              # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                              # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                              #  
                                                                              # PARAMETERS  
                                                                              #   REQUIRED:  
                                                                              #      input file in fasta format  
                                                                              #   Optional  
                                                                              #      -o output file name  
                                                                              #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                              #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                              #      -k keep temp files  
                                                                              #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                                
                                                                              parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                              parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                              parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                              parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=24', default='24')  
                                                                              parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                              parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                              parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                              results = parser.parse_args()  
                                                                              infile = results.infile  
                                                                              outfile = results.outfile  
                                                                              minlen = int(results.minlen)  
                                                                              blast_path = results.blast_path  
                                                                              keep = results.keep  
                                                                              genbank = results.genbank  
                                                                                
                                                                              # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                              # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                              # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                              wordsize = str(minlen)  
                                                                                
                                                                              # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                              # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                              if outfile == 'default':  
                                                                                  outfile = infile  
                                                                                  if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                      for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                          index = outfile.index('/')  
                                                                                          outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                  if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                      outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                  outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                              outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                              outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                              outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                              outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                              outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                              tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                              temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                              tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                
                                                                              # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                              seq = open(infile, 'r')  
                                                                              seqname = seq.readline()  
                                                                              seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                              seqname = seqname.rstrip()  
                                                                              seqlen = 0   
                                                                              for line in seq:  
                                                                                  if(line[0] == ">"):  
                                                                                      continue  
                                                                                  seqlen += len(line.strip())  
                                                                              seq.close()  
                                                                                
                                                                              # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                              print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                              os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                              os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                
                                                                              # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                              # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                
                                                                              print 'Sorting alignments...'  
                                                                              f = open(tempblast, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(f)  
                                                                              alignments = list(reader)  
                                                                              f.close()  
                                                                              alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                              alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                
                                                                              # New list of uniques  
                                                                              # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                              # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                              # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                              # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                              # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                              # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                              print 'Finding unique repeats...'  
                                                                              uniques = []  
                                                                              sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                              for row in range(len(alignments)):  
                                                                                  sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                  if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                      # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                      # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                      sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                      break  
                                                                                  else:  
                                                                                    
                                                                                      for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                          if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                              uniques.append(alignments[row])  
                                                                                              sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                              break  
                                                                                          else:  
                                                                                              sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                              if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              else:  
                                                                                                  sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                
                                                                              sp.close()  
                                                                                
                                                                              # Write uniques into output file  
                                                                              # Start list for copy number table  
                                                                              rous_count = 0  
                                                                              g = open(outfa, 'w')  
                                                                              repcopies = []  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(uniques)):  
                                                                                  qstart = uniques[i][0]  
                                                                                  qend = uniques[i][1]  
                                                                                  length = uniques[i][2]  
                                                                                  seq = uniques[i][7]  
                                                                                    
                                                                                  rous_count += 1  
                                                                                  g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                  repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                        
                                                                              if rous_count == 0:  
                                                                                  print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                              g.close()  
                                                                              print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                
                                                                              # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                              # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                              # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                
                                                                              print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                              g = open(outfa, 'r')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp" > '+temprepeats)  
                                                                              g.close()  
                                                                                
                                                                              tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(tempr)  
                                                                              replist = list(reader)  
                                                                              tempr.close()  
                                                                                
                                                                              print "Making a table of the repeats..."  
                                                                              sum_rep_len = 0  
                                                                              bin_dict = {}  
                                                                              binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                
                                                                              # defining the bins  
                                                                              i = 0  
                                                                              j = 50  
                                                                              while j < 1000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i += 1  
                                                                                  j += 50  
                                                                              while j <= 10000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i +=1  
                                                                                  j += 250  
                                                                                    
                                                                              # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                              posit = []  
                                                                              for n in range(seqlen):  
                                                                                  posit.append(0)  
                                                                                
                                                                              # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                              # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                              # make list for genbank file  
                                                                              # Keep stats on lengths  
                                                                              rt = open(outtab, 'w')  
                                                                              rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n')  
                                                                              templist = []  
                                                                              gblist =[]  
                                                                                
                                                                              # look at each repeat in turn  
                                                                              for i in range(len(replist)):  
                                                                                  # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                  if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                      rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\t'+str(replist[i][4])+'\n')  
                                                                                      if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                          location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                      else:  
                                                                                          location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                      gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                      templist.append(replist[i][0])  
                                                                                      # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                      # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                      # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                      for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                          posit[n] = 1  
                                                                                      # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                      # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                      for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                          if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                              binned[j+3] +=1  
                                                                                              break  
                                                                              sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                              binned[2] = sum_rep_len  
                                                                              rt.close()  
                                                                              if genbank == True:  
                                                                                  gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                  for i in range(len(gblist)):  
                                                                                      gb.write(gblist[i])  
                                                                                  gb.close()  
                                                                                
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                              # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                              rc = open(outcount,'w')  
                                                                              rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumRepeats\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                
                                                                              numrous = 0  
                                                                              sizerous = 0  
                                                                              copyrous = 0  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  repname = repcopies[i][0]  
                                                                                  replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                  repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                
                                                                                  numrous += 1  
                                                                                  sizerous += replen  
                                                                                  copyrous += repcop  
                                                                                
                                                                              if numrous == 0:  
                                                                                  avsizerous = 'NA'  
                                                                                  avcopyrous = 'NA'  
                                                                              else:  
                                                                                  avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                  avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                
                                                                                
                                                                              rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                
                                                                              rc.close()  
                                                                                
                                                                              # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                              binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                              binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                              for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                  binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              for i in range(len(binned)):  
                                                                                  binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              binfile.close()  
                                                                              print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                
                                                                              # Removing temp files if necessary  
                                                                              if keep == False:  
                                                                                  os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                
                                                                              # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                              quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                              import random, binascii  
                                                                              z = random.randint(0,10)  
                                                                              print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. MultipleRepeats.py
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • MultipleRepeats.py批量运行一个文件夹下的每个序列文件。
                                                                                • +
                                                                              • 脚本贴在下面：
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              #! /usr/bin/env python  
                                                                              import sys, math, os, argparse  
                                                                                
                                                                              # Usage: -din directory of files to find repeats in  
                                                                              #        -word word_size  
                                                                                
                                                                              parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a directory of fasta sequence files')  
                                                                              parser.add_argument('-din', action='store', dest='din', help='Input .fasta directory')  
                                                                              parser.add_argument('-word', action='store', dest='word', help='Word size for blast')  
                                                                              results = parser.parse_args()  
                                                                              din = results.din  
                                                                              word = results.word  
                                                                                
                                                                              li = os.listdir(din)  
                                                                              inputs = filter(lambda x: '.fasta' in x, li)  
                                                                              inputs.sort()  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(inputs)):  
                                                                                  infile = str(inputs[i])  
                                                                                  os.system("/home/alan/applications/ROUSFinder.py -m "+word+" "+din+infile)
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. ROUSFinder2.py
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • ROUSFinder2.py可以在命令行设置match赏分和mismatch罚分。
                                                                                • +
                                                                              • 脚本贴在下面：
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              #! /usr/bin/env python  
                                                                              import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                              csv.field_size_limit(sys.maxsize)  
                                                                                
                                                                              # Version 2.0, November 21, 2018  
                                                                              # Changes: uses variable parameters  
                                                                              # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                              # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                              # May be very slow with larger genomes.   
                                                                              # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                              # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                              # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                              # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                              # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                              # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                              # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                              # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                              # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                              # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                              # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                              # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                              # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                              #  
                                                                              # PARAMETERS  
                                                                              #   REQUIRED:  
                                                                              #      input file in fasta format  
                                                                              #   Optional  
                                                                              #      -o output file name  
                                                                              #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                              #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                              #      -k keep temp files  
                                                                              #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                              #      -rew reward for match (default is 1)  
                                                                              #      -pen penalty for mismatch (default is 20)  
                                                                                
                                                                              parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                              parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                              parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                              parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=50', default='50')  
                                                                              parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                              parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                              parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                              parser.add_argument('-rew', action='store', dest='reward', help='Reward for match', default='1')  
                                                                              parser.add_argument('-pen', action='store', dest='penalty', help='Penalty for mismatch', default='20')  
                                                                              results = parser.parse_args()  
                                                                              infile = results.infile  
                                                                              outfile = results.outfile  
                                                                              minlen = int(results.minlen)  
                                                                              blast_path = results.blast_path  
                                                                              keep = results.keep  
                                                                              genbank = results.genbank  
                                                                              reward = results.reward  
                                                                              penalty = results.penalty  
                                                                                
                                                                              # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                              # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                              # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                              wordsize = str(minlen)  
                                                                                
                                                                              # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                              # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                              if outfile == 'default':  
                                                                                  outfile = infile  
                                                                                  if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                      for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                          index = outfile.index('/')  
                                                                                          outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                  if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                      outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                  outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                              outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                              outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                              outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                              outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                              outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                              tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                              temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                              tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                
                                                                              # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                              seq = open(infile, 'r')  
                                                                              seqname = seq.readline()  
                                                                              seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                              seqname = seqname.rstrip()  
                                                                              seqlen = 0   
                                                                              for line in seq:  
                                                                                  if(line[0] == ">"):  
                                                                                      continue  
                                                                                  seqlen += len(line.strip())  
                                                                              seq.close()  
                                                                                
                                                                              # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                              print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname      
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10  -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                              os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                              os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                
                                                                              # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                              # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                
                                                                              print 'Sorting alignments...'  
                                                                              f = open(tempblast, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(f)  
                                                                              alignments = list(reader)  
                                                                              f.close()  
                                                                              alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                              alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                
                                                                              # New list of uniques  
                                                                              # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                              # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                              # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                              # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                              # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                              # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                              print 'Finding unique repeats...'  
                                                                              uniques = []  
                                                                              sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                              for row in range(len(alignments)):  
                                                                                  sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                  if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                      # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                      # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                      sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                      break  
                                                                                  else:  
                                                                                    
                                                                                      for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                          if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                              uniques.append(alignments[row])  
                                                                                              sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                              break  
                                                                                          else:  
                                                                                              sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                              if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              else:  
                                                                                                  sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                
                                                                              sp.close()  
                                                                                
                                                                              # Write uniques into output file  
                                                                              # Start list for copy number table  
                                                                              rous_count = 0  
                                                                              g = open(outfa, 'w')  
                                                                              repcopies = []  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(uniques)):  
                                                                                  qstart = uniques[i][0]  
                                                                                  qend = uniques[i][1]  
                                                                                  length = uniques[i][2]  
                                                                                  seq = uniques[i][7]  
                                                                                    
                                                                                  rous_count += 1  
                                                                                  g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                  repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                        
                                                                              if rous_count == 0:  
                                                                                  print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                              g.close()  
                                                                              print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                
                                                                              # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                              # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                              # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                
                                                                              print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                              g = open(outfa, 'r')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp" > '+temprepeats)  
                                                                              g.close()  
                                                                                
                                                                              tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(tempr)  
                                                                              replist = list(reader)  
                                                                              tempr.close()  
                                                                                
                                                                              print "Making a table of the repeats..."  
                                                                              sum_rep_len = 0  
                                                                              bin_dict = {}  
                                                                              binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                
                                                                              # defining the bins  
                                                                              i = 0  
                                                                              j = 50  
                                                                              while j < 1000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i += 1  
                                                                                  j += 50  
                                                                              while j <= 10000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i +=1  
                                                                                  j += 250  
                                                                                    
                                                                              # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                              posit = []  
                                                                              for n in range(seqlen):  
                                                                                  posit.append(0)  
                                                                                
                                                                              # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                              # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                              # make list for genbank file  
                                                                              # Keep stats on lengths  
                                                                              rt = open(outtab, 'w')  
                                                                              rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n')  
                                                                              templist = []  
                                                                              gblist =[]  
                                                                                
                                                                              # look at each repeat in turn  
                                                                              for i in range(len(replist)):  
                                                                                  # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                  if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                      rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\t'+str(replist[i][4])+'\n')  
                                                                                      if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                          location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                      else:  
                                                                                          location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                      gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                      templist.append(replist[i][0])  
                                                                                      # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                      # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                      # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                      for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                          posit[n] = 1  
                                                                                      # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                      # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                      for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                          if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                              binned[j+3] +=1  
                                                                                              break  
                                                                              sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                              binned[2] = sum_rep_len  
                                                                              rt.close()  
                                                                              if genbank == True:  
                                                                                  gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                  for i in range(len(gblist)):  
                                                                                      gb.write(gblist[i])  
                                                                                  gb.close()  
                                                                                
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                              # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                              rc = open(outcount,'w')  
                                                                              rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumROUS\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                
                                                                              numrous = 0  
                                                                              sizerous = 0  
                                                                              copyrous = 0  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  repname = repcopies[i][0]  
                                                                                  replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                  repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                
                                                                                  numrous += 1  
                                                                                  sizerous += replen  
                                                                                  copyrous += repcop  
                                                                                
                                                                              if numrous == 0:  
                                                                                  avsizerous = 'NA'  
                                                                                  avcopyrous = 'NA'  
                                                                              else:  
                                                                                  avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                  avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                
                                                                                
                                                                              rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                
                                                                              rc.close()  
                                                                                
                                                                              # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                              binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                              binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                              for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                  binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              for i in range(len(binned)):  
                                                                                  binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              binfile.close()  
                                                                              print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                
                                                                              # Removing temp files if necessary  
                                                                              if keep == False:  
                                                                                  os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                
                                                                              # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                              quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                              import random, binascii  
                                                                              z = random.randint(0,10)  
                                                                              print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                              + +

                                                                              2.2. 运行脚本鉴定重复

                                                                              选择ROUSFinder2.py脚本来鉴定线粒体的重复序列。

                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 脚本参数
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 必需参数：fasta格式的输入序列
                                                                                • +
                                                                              • -o out：输出文件名称
                                                                                • +
                                                                              • -m 50：鉴定的重复序列的最小长度，默认是50bp。
                                                                                • +
                                                                              • -b /path/to/blastn/：blastn命令的路径，默认是/usr/bin/。
                                                                                • +
                                                                              • -k：保留临时文件，out_tempblast.txt和out_temprepeats.txt
                                                                                • +
                                                                              • -gb：生成重复序列的genbank格式文件，out_repeats.gb.txt
                                                                                • +
                                                                              • -rew 1：match赏分，默认是+1
                                                                                • +
                                                                              • -pen 20：mismatch罚分，默认是-20
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 运行脚本
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • ROUSFinder2.py input.fa -m 30 -gb -o out
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              2.3. 结果文件

                                                                                +
                                                                              1. out_rep_table.txt：包含每个repeat单元的名称，长度，起始位置和终止位置，正负链（plus或minus）。
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 第一行显示了第一个染色体的名称和长度。
                                                                                • +
                                                                              • 后面的行有五列，分别是repeat名称，repeat长度，repeat在染色体序列上的起始位置和终止位置，repeat的正负链方向。
                                                                                • +
                                                                              • 通常前面只有一行信息的重复单元（如Repeat_1和Repeat_2）需要手动去除，留下后面有2个或以上重复单元的信息（如Repeat_3和Repeat_4）作为重复序列鉴定的结果。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              Chr01	147501
                                                                              Repeat_1	2702	1	2702	plus
                                                                              Repeat_2	2480	1	2480	plus
                                                                              Repeat_3	1171	1933	3103	plus
                                                                              Repeat_3	1171	2322	3492	plus
                                                                              Repeat_4	938	1696	2633	plus
                                                                              Repeat_4	938	2237	3174	plus
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. out_rep.fasta：包含fasta格式的repeat序列
                                                                                2. +
                                                                              2. out_rep_counts.txt：包含repeat的总数（NumROUS），平均长度（AvgSize），平均数量（AvgCopyNum），和每个repeat的长度和数量。
                                                                                3. +
                                                                              3. out_repeats.gb.txt：使用-gb参数则生成此文件，是genbank格式的repeat的注释文件。
                                                                                4. +
                                                                              4. out_binned.txt：包含>50bp,100bp,150bp,…,1000bp,1250bp,1500bp,…,10000bp的repeat的数量
                                                                                5. +
                                                                              5. out_tempblast.txt：使用-k参数会保留两个临时temp文件
                                                                                6. +
                                                                              6. out_temprepeats.txt：使用-k参数会保留两个临时temp文件。
                                                                                7. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • out_temprepeats.txt是用重复单元与输入序列做blastn的-outfmt 10的结果，包含qseqid length sstart send sstrand qcovhsp六列内容。
                                                                                • +
                                                                              • out_rep_table.txt结果文件是从这个out_temprepeats.txt临时文件中提取生成的。
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              2.4. 修改鉴定重复的脚本，使其显示重复序列所在染色体位置

                                                                              ROUSFinder2.py脚本鉴定线粒体的重复序列是被设计的用于鉴定一条序列与自身的重复，所以结果文件中不包含重复所在染色体位置信息。好在脚本容易修改，就修改了脚本使其显示染色体位置，可用于多染色体线粒体基因组的重复序列鉴定。

                                                                              +

                                                                              使用修改后脚本的输出结果中两个文件（out_rep_table.txt和out_temprepeats.txt）有所不同，其他结果文件都与修改前的脚本的结果一致。

                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 修改后的脚本ROUSFinder2.0_adjusted.by.yz.py
                                                                                2. +
                                                                              + +
                                                                              #! /usr/bin/env python  
                                                                              import sys, math, os, argparse, csv  
                                                                              csv.field_size_limit(sys.maxsize)  

                                                                              # minior adjustments by Yan Zhong, November 27, 2023  
                                                                              # Version 2.0, November 21, 2018  
                                                                              # Changes: uses variable parameters  
                                                                              # Find dispersed repeated sequences in genomes.   
                                                                              # Designed for plant mitochondrial genomes of up to a few Mbp.  
                                                                              # May be very slow with larger genomes.   
                                                                              # Blast can also sometimes give odd results with large or highly repetetive genomes.  
                                                                              # Gaps, or runs of 'N's in the sequence will definitely give weird results.   
                                                                              # The program assumes there aren't any, and that the longest repeat will be the full sequence to itself.  
                                                                              # If there are long repeats in the output that are listed as being only at one location, this is probably what happened.  
                                                                              # If there are a lot of repeats within repeats the results can also be odd.  
                                                                              # Copyright Alan C. Christensen, University of Nebraska, 2018  
                                                                              # No guarantees, warranties, support, or anything else is implicit or explicit.  
                                                                              # Input is a fasta format file of a sequence. Genbank format works but generates lots of error messages in stdout.  
                                                                              # Output is a list of unique, ungapped repeated sequences, fasta formatted.  
                                                                              # The names are in the format '>Repeat/ROUS_name_start_end_length'.  
                                                                              # A table of repeats with the coordinates of each one is generated.  
                                                                              # A list of repeat name, length and copy number is generated.  
                                                                              # A binned table of the total number of repeats in size ranges is generated.  
                                                                              #  
                                                                              # PARAMETERS  
                                                                              #   REQUIRED:  
                                                                              #      input file in fasta format  
                                                                              #   Optional  
                                                                              #      -o output file name  
                                                                              #      -m minimum length of exact matches to keep  
                                                                              #      -b path to blastn (default is /usr/bin/)  
                                                                              #      -k keep temp files  
                                                                              #      -gb to write the repeats to a genbank format file  
                                                                              #      -rew reward for match (default is 1)  
                                                                              #      -pen penalty for mismatch (default is 20)  
                                                                                
                                                                              parser = argparse.ArgumentParser(description='Find repeats in a fasta sequence file')  
                                                                              parser.add_argument('infile', action='store', help='Input .fasta file')  
                                                                              parser.add_argument('-o', action='store', dest='outfile', help='Output file name seed, default is input_repeats', default='default')  
                                                                              parser.add_argument('-m', action='store', dest='minlen', help='Minimum length of matches to keep, default=50', default='50')  
                                                                              parser.add_argument('-b', action='store', dest='blast_path', help='Path to blastn program, default is /usr/bin/', default='/usr/bin/')  
                                                                              parser.add_argument('-k', action='store_true', dest='keep', help='True to keep temp files', default=False)  
                                                                              parser.add_argument('-gb', action='store_true', dest='genbank', help='True to write GenBank format file', default=False)  
                                                                              parser.add_argument('-rew', action='store', dest='reward', help='Reward for match', default='1')  
                                                                              parser.add_argument('-pen', action='store', dest='penalty', help='Penalty for mismatch', default='20')  
                                                                              results = parser.parse_args()  
                                                                              infile = results.infile  
                                                                              outfile = results.outfile  
                                                                              minlen = int(results.minlen)  
                                                                              blast_path = results.blast_path  
                                                                              keep = results.keep  
                                                                              genbank = results.genbank  
                                                                              reward = results.reward  
                                                                              penalty = results.penalty  
                                                                                
                                                                              # It might be useful to define the wordsize as something less than minlen, so both variables are used.  
                                                                              # Wordsize smaller than minlen would give smaller core identical sequences in the middle of repeats.  
                                                                              # An example might be to change this to wordsize = str(int(minlen/2)).  
                                                                              wordsize = str(minlen)  
                                                                                
                                                                              # If no output file seed is specified, make one by stripping leading directory information  
                                                                              # and stripping trailing .fa or .fasta from the input file name and using that.  
                                                                              if outfile == 'default':  
                                                                                  outfile = infile  
                                                                                  if outfile.count('/') > 0:  
                                                                                      for i in range(outfile.count('/')):  
                                                                                          index = outfile.index('/')  
                                                                                          outfile = outfile[index+1:]  
                                                                                  if outfile.endswith('.fa') or outfile.endswith('.fasta'):  
                                                                                      outfile = outfile.rstrip('fasta')  
                                                                                  outfile = outfile.rstrip('.')  
                                                                              outfa = outfile+'_rep.fasta'  
                                                                              outtab = outfile+'_rep_table.txt'  
                                                                              outbin = outfile+'_binned.txt'  
                                                                              outcount = outfile+'_rep_counts.txt'  
                                                                              outgb = outfile+'_repeats.gb.txt'  
                                                                              tempblast = outfile+'_tempblast.txt'  
                                                                              temprepeats = outfile+'_temprepeats.txt'  
                                                                              tempparse = outfile+'_sequence_parsing.txt'  
                                                                                
                                                                              # Get sequence name and length from fasta file.  
                                                                              seq = open(infile, 'r')  
                                                                              seqname = seq.readline()  
                                                                              seqname = seqname.lstrip('> ')  
                                                                              seqname = seqname.rstrip()  
                                                                              seqlen = 0   
                                                                              for line in seq:  
                                                                                  if(line[0] == ">"):  
                                                                                      continue  
                                                                                  seqlen += len(line.strip())  
                                                                              seq.close()  
                                                                                
                                                                              # run blastn with query file plus strand (removing first line which is full length sequence), minus strand, and concatenate  
                                                                              print 'Performing self-blastn comparison with '+seqname      
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand plus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10  -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" | tail -n+2 > tempblast1.txt')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+infile+' -strand minus -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward '+reward+' -penalty -'+penalty+' -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 10 -outfmt "10 qstart qend length sstart send mismatch sstrand qseq" > tempblast2.txt')  
                                                                              os.system('cat tempblast1.txt tempblast2.txt > '+tempblast)  
                                                                              os.system('rm tempblast1.txt tempblast2.txt')  
                                                                                
                                                                              # open tempblast.txt, convert to list of lists, and sort by length and position descending  
                                                                              # This is necessary because blastn does not output every possible pair of hits when there are more than 2 copies of a repeat  
                                                                                
                                                                              print 'Sorting alignments...'  
                                                                              f = open(tempblast, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(f)  
                                                                              alignments = list(reader)  
                                                                              f.close()  
                                                                              alignments = sorted(alignments, key=lambda x: (-1*int(x[2]), -1*int(x[0])))  
                                                                              alignments.append(['1','1','1','1','1','0','A','X'])  
                                                                                
                                                                              # New list of uniques  
                                                                              # Text file '_sequence_parsing.txt' includes the information on how duplicates were found.  
                                                                              # Start at row 0. Compare to subsequent rows.   
                                                                              # If repeat length is different from the next row, it has passed all the tests, write it to the file.  
                                                                              # If query or subject coordinates are the same as the query or subject or reversed coordinates  
                                                                              # of a subsequent row, it is not unique, so go to the next row and do the comparisons again.  
                                                                              # Thanks to Alex Kozik for repeatedly testing and finding bugs in the algorithm.  
                                                                              print 'Finding unique repeats...'  
                                                                              uniques = []  
                                                                              sp = open(tempparse, 'w')  
                                                                              for row in range(len(alignments)):  
                                                                                  sp.write('row '+str(row)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                  if int(alignments[row][2]) < minlen:  
                                                                                      # This won't happen unless the word_size is defined as something other than minlen.  
                                                                                      # That could be useful under some circumstances.  
                                                                                      sp.write('row '+str(row)+' is less than minlength')  
                                                                                      break  
                                                                                  else:  
                                                                                    
                                                                                      for compare in range(row+1,len(alignments)):  
                                                                                          if alignments[row][2] != alignments[compare][2]:   
                                                                                              uniques.append(alignments[row])  
                                                                                              sp.write('\tadding row '+str(row)+' to unique list\n')  
                                                                                              break  
                                                                                          else:  
                                                                                              sp.write('\tcomparing to '+str(compare)+'\n')  
                                                                                    
                                                                                              if alignments[row][0] == alignments[compare][0] and alignments[row][1] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' and '+str(compare)+' are the same\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][1] and alignments[row][1] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][3] and alignments[row][1] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][0] == alignments[compare][4] and alignments[row][1] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tqstart and qend of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][0] and alignments[row][4] == alignments[compare][1]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qstart and qend of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][1] and alignments[row][4] == alignments[compare][0]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as qend and qstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][3] and alignments[row][4] == alignments[compare][4]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as sstart and send of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              elif alignments[row][3] == alignments[compare][4] and alignments[row][4] == alignments[compare][3]:  
                                                                                                  sp.write('\tsstart and send of row '+str(row)+' is the same as send and sstart of '+str(compare)+'\n')  
                                                                                                  break  
                                                                                              else:  
                                                                                                  sp.write('\t'+str(row)+' is different\n')  
                                                                                
                                                                              sp.close()  
                                                                                
                                                                              # Write uniques into output file  
                                                                              # Start list for copy number table  
                                                                              rous_count = 0  
                                                                              g = open(outfa, 'w')  
                                                                              repcopies = []  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(uniques)):  
                                                                                  qstart = uniques[i][0]  
                                                                                  qend = uniques[i][1]  
                                                                                  length = uniques[i][2]  
                                                                                  seq = uniques[i][7]  
                                                                                    
                                                                                  rous_count += 1  
                                                                                  g.write('>Repeat_'+str(rous_count)+'\n'+seq+'\n')  
                                                                                  repcopies.append(['Repeat_'+str(rous_count),length])  
                                                                                        
                                                                              if rous_count == 0:  
                                                                                  print "\tRepeats of unusual size? I don't think they exist"  
                                                                              g.close()  
                                                                              print 'Repeat fasta file is done, as you wish.'  
                                                                                
                                                                              # Now find each copy of each repeat. Again, this is because the blastn output file does not have every possible alignment.  
                                                                              # It is also because the information on locations and strand is not organized well in the blastn output.  
                                                                              # In addition, this subroutine eliminates duplicates of nested repeats.  
                                                                                
                                                                              print "Finding all copies of repeats..."  
                                                                              g = open(outfa, 'r')  
                                                                              os.system(blast_path+'blastn -query '+outfa+' -strand both -subject '+infile+' -word_size '+wordsize+' -reward 1 -penalty -20 -ungapped -dust no -soft_masking false -evalue 1000 -outfmt "10 qseqid length sstart send sstrand qcovhsp sseqid qstart qend" > '+temprepeats)  # adjusted by yz
                                                                              g.close()  
                                                                                
                                                                              tempr = open(temprepeats, 'r')  
                                                                              reader = csv.reader(tempr)  
                                                                              replist = list(reader)  
                                                                              tempr.close()  
                                                                                
                                                                              print "Making a table of the repeats..."  
                                                                              sum_rep_len = 0  
                                                                              bin_dict = {}  
                                                                              binned = [seqname,seqlen,0]  
                                                                                
                                                                              # defining the bins  
                                                                              i = 0  
                                                                              j = 50  
                                                                              while j < 1000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i += 1  
                                                                                  j += 50  
                                                                              while j <= 10000:  
                                                                                  bin_dict[i] = j  
                                                                                  binned.append(0)  
                                                                                  i +=1  
                                                                                  j += 250  
                                                                                    
                                                                              # make list for entire sequence, set each position as 0  
                                                                              posit = []  
                                                                              for n in range(seqlen):  
                                                                                  posit.append(0)  
                                                                                
                                                                              # Thanks to Emily Wynn for suggesting qcovhsp for this loop.  
                                                                              # if qcovhsp is >98%, write to the file  
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, start, end, strand to outtab  
                                                                              # make list for genbank file  
                                                                              # Keep stats on lengths  
                                                                              rt = open(outtab, 'w')  
                                                                              # rt.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\n') # adjusted by yz
                                                                              rt.write('repeat.name'+'\t'+'alignment.length'+'\t'+'repeat.start'+'\t'+'repeat.end'+'\t'+'strand'+'\t'+'qcovhsp'+'\t'+'chr.name'+'\t'+'chr.start'+'\t'+'chr.end'+'\n')  # adjusted by yz
                                                                              templist = []  
                                                                              gblist =[]  
                                                                                
                                                                              # look at each repeat in turn  
                                                                              for i in range(len(replist)):  
                                                                                  # if repeat is good (>98% identical to another one), write it to the file, and put the name in a list  
                                                                                  if int(replist[i][5])>98:  
                                                                                      rt.write(str(replist[i][0])+'\t'+str(replist[i][1])+'\t'+str(replist[i][7])+'\t'+str(replist[i][8])+'\t'+str(replist[i][4])+'\t'+str(replist[i][5])+'\t'+str(replist[i][6])+'\t'+str(replist[i][2])+'\t'+str(replist[i][3])+'\n')  # adjusted by yz
                                                                                      if replist[i][4] == 'minus':  
                                                                                          location = 'complement('+replist[i][3]+'..'+replist[i][2]+')'  
                                                                                      else:  
                                                                                          location = replist[i][2]+'..'+replist[i][3]  
                                                                                      gblist.append('     repeat_region   '+location+'\n                     /rpt_type=dispersed\n                     /label='+replist[i][0]+'\n')  
                                                                                      templist.append(replist[i][0])  
                                                                                      # then write 1's at every position in the sequence covered by that repeat  
                                                                                      # these can then be summed to get total bases of repeats  
                                                                                      # bases in overlapping repeats are only counted once  
                                                                                      for n in range(int(replist[i][2]), int(replist[i][3])):  
                                                                                          posit[n] = 1  
                                                                                      # then scan through bin sizes and if a repeat is greater than the  
                                                                                      # bin_dict size cutoff, add one to the bin  
                                                                                      for j in range(len(binned)-4, -1, -1):  
                                                                                          if int(replist[i][1]) >= bin_dict[j]:  
                                                                                              binned[j+3] +=1  
                                                                                              break  
                                                                              sum_rep_len = posit.count(1)  
                                                                              binned[2] = sum_rep_len  
                                                                              rt.close()  
                                                                              if genbank == True:  
                                                                                  gb = open(outgb, 'w')  
                                                                                  for i in range(len(gblist)):  
                                                                                      gb.write(gblist[i])  
                                                                                  gb.close()  
                                                                                
                                                                              # write tab separated values of repeat name, length, copy number to outcount  
                                                                              # first two lines are also a table of stats on repeats  
                                                                              rc = open(outcount,'w')  
                                                                              rc.write('Sequence\tGenome_size\tNumROUS\tAvgSize\tAvgCopyNum\n')  
                                                                                
                                                                              numrous = 0  
                                                                              sizerous = 0  
                                                                              copyrous = 0  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  repname = repcopies[i][0]  
                                                                                  replen = float(repcopies[i][1])  
                                                                                  repcop = float(templist.count(repname))  
                                                                                
                                                                                  numrous += 1  
                                                                                  sizerous += replen  
                                                                                  copyrous += repcop  
                                                                                
                                                                              if numrous == 0:  
                                                                                  avsizerous = 'NA'  
                                                                                  avcopyrous = 'NA'  
                                                                              else:  
                                                                                  avsizerous = sizerous/numrous  
                                                                                  avcopyrous = copyrous/numrous  
                                                                                
                                                                                
                                                                              rc.write(seqname+'\t'+str(seqlen)+'\t'+str(numrous)+'\t'+str(avsizerous)+'\t'+str(avcopyrous)+'\n')  
                                                                                
                                                                              for i in range(len(repcopies)):  
                                                                                  rc.write(repcopies[i][0]+'\t'+repcopies[i][1]+'\t'+str(templist.count(repcopies[i][0]))+'\n')  
                                                                                
                                                                              rc.close()  
                                                                                
                                                                              # Write binned table headers, then stats for this sequence.  
                                                                              binfile = open(outbin, 'w')  
                                                                              binfile.write('Sequence\tSeq_len\tRep_len\t')  
                                                                              for i in range(len(bin_dict)):  
                                                                                  binfile.write(str(bin_dict[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              for i in range(len(binned)):  
                                                                                  binfile.write(str(binned[i])+'\t')  
                                                                              binfile.write('\n')  
                                                                              binfile.close()  
                                                                              print "Repeat tables are done, as you wish."  
                                                                                
                                                                              # Removing temp files if necessary  
                                                                              if keep == False:  
                                                                                  os.system('rm '+tempblast+' '+temprepeats+' '+tempparse)  
                                                                                
                                                                              # Rachael Schulte, William Goldman and Rob Reiner inspired this section of code  
                                                                              quote_dict = {0:"48656c6c6f2e204d79206e616d6520697320496e69676f204d6f6e746f79612e20596f75206b696c6c6564206d79206661746865722e205072657061726520746f206469652e", 1:"5768656e20492077617320796f7572206167652c2074656c65766973696f6e207761732063616c6c656420626f6f6b732e", 2:"486176652066756e2073746f726d696e2720646120636173746c6521", 3:"4d79207761792773206e6f7420766572792073706f7274736d616e6c696b652e", 4:"596f75206b656570207573696e67207468617420776f72642e204920646f206e6f74207468696e6b206974206d65616e73207768617420796f75207468696e6b206974206d65616e732e", 5:"4d75726465726564206279207069726174657320697320676f6f642e",6:"496e636f6e6365697661626c6521", 7:"5468657265277320612062696720646966666572656e6365206265747765656e206d6f73746c79206465616420616e6420616c6c20646561642e", 8:"596f7520727573682061206d697261636c65206d616e2c20796f752067657420726f7474656e206d697261636c65732e", 9:"476f6f64206e696768742c20576573746c65792e20476f6f6420776f726b2e20536c6565702077656c6c2e2049276c6c206d6f7374206c696b656c79206b696c6c20796f7520696e20746865206d6f726e696e672e",10:"4e6f206d6f7265207268796d65732c2049206d65616e2069742120416e79626f64792077616e742061207065616e75743f"}  
                                                                              import random, binascii  
                                                                              z = random.randint(0,10)  
                                                                              print binascii.unhexlify(quote_dict[z])+'\n'
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. 修改前脚本的结果文件out_rep_table.txt
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 第一行显示了第一个染色体的名称和长度。
                                                                                • +
                                                                              • 后面的行有五列，分别是重复单元的名称(repeat.name)，重复单元的长度(alignment.length)，重复单元在输入的染色体序列上的起始位置和终止位置(chr.start和chr.end)，重复单元的正负链方向(strand)。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              Chr01	147501
                                                                              Repeat_1	2702	1	2702	plus
                                                                              Repeat_2	2480	1	2480	plus
                                                                              Repeat_3	1171	1933	3103	plus
                                                                              Repeat_3	1171	2322	3492	plus
                                                                              Repeat_4	938	1696	2633	plus
                                                                              Repeat_4	938	2237	3174	plus
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. 修改后脚本的结果文件out_rep_table.txt
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 添加了标题行。包含重复单元的名称(repeat.name)，重复单元的长度(alignment.length)，重复单元在重复序列上起始和终止位置(repeat.start和repeat.end)，重复单元的正负链方向(strand)，每个高度相似片段HSP中的重复单元的覆盖度(Query Coverage Per HSP, qcovhsp)，染色体序列名称(chr.name)，重复单元在输入的染色体序列上的起始位置和终止位置(chr.start和chr.end)。
                                                                                • +
                                                                              • 添加了列的展示，主要是染色体序列名称(chr.name)，还包括repeat.start和repeat.end，qcovhsp。
                                                                                • +
                                                                              • 调整了列的展示顺序。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                              repeat.name	alignment.length	repeat.start	repeat.end	strand	qcovhsp	chr.name	chr.start	chr.end
                                                                              Repeat_1	2702	1	2702	plus	100	Chr38	1	2702
                                                                              Repeat_2	2480	1	2480	plus	100	Chr39	1	2480
                                                                              Repeat_3	1171	1	1171	plus	100	Chr34	1933	3103
                                                                              Repeat_3	1171	1	1171	plus	100	Chr09	2322	3492
                                                                              Repeat_4	938	1	938	plus	100	Chr38	1696	2633
                                                                              Repeat_4	938	1	938	plus	100	Chr32	2237	3174
                                                                              + +
                                                                                +
                                                                              1. 修改后脚本的结果文件out_temprepeats.txt
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 修改后脚本的结果文件out_temprepeats.txt比起修改前在后面多加了三列信息chr.name,repeat.start和repeat.end。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. notes（与脚本的修改无关）
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 从修改后脚本的结果文件out_rep_table.txt的示例文件可看出，qcovhsp列绝大部分情况下是100，因为这个值高于98才会被鉴定为重复单元。
                                                                                • +
                                                                              • repeat.start和repeat.end两列的值也一般是固定的，从1到重复单元的末位。这两列值是用重复序列与输入序列做blast，比对结果中比对到的重复序列的重复单元的位置，通常只有完全比对上（repeat.start和repeat.end两列值从1到重复单元的末位）的才被鉴定为重复单元。
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              2.5. 重复的应用

                                                                                +
                                                                              1. 辅助线粒体组装
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 通过鉴定出来的重复，可以帮助线粒体组装得更完整。
                                                                                • +
                                                                              • 调整线粒体的已有组装。比如通过计算重组率，把主导的优势构象作为最后的线粒体组装构象。
                                                                                • +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 鉴定重组
                                                                                2. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 重复序列可能介导重组，所以鉴定重复是鉴定重组的基础。
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              3. 鉴定重组和计算重组率

                                                                              鉴定出线粒体的重复序列后，还可以进一步鉴定这些重复序列是否介导了重组。

                                                                              +

                                                                              重组会导致构象的变化，构象变化的形式包括：

                                                                              +
                                                                                +
                                                                              1. 位于不同染色体环上的一对重复序列可能介导重组，使得两个小环变成一个大环。
                                                                                2. +
                                                                              2. 位于同一个染色体环上的同方向的一对重复序列可能介导重组，使得一个大环变成两个小环。
                                                                                3. +
                                                                              3. 位于同一个染色体环上的反方向的一对重复序列，可能在其他重复对的重组变换下变成同方向或者两个小环的状态。
                                                                                4. +
                                                                              +

                                                                              3.1. 鉴定重组的步骤

                                                                              3.1.1. 构建参考构象和重组构象的序列

                                                                                +
                                                                              1. 针对一对可能造成重组的重复序列，构建参考构象和重组构象
                                                                                2. +
                                                                              2. 在参考构象和重组构象中，以重复序列加上两翼各300bp作为参考构象序列(ref_1和ref_2)和重组构象序列(rec_1和rec_2)
                                                                                3. +
                                                                              3. 构建参考序列和mapping注意事项
                                                                                4. +
                                                                              +
                                                                                +
                                                                              • 可以把参考构象序列和重组构象序列（一共四条）一同作为参考序列（reference）用于mapping，避免同一条reads mapping到多个构象序列从而重复计数的情况。
                                                                                • +
                                                                              • 如果担心叶绿体派生的reads影响重组率的计算，还可以加上叶绿体基因组作为参考序列（reference），这样叶绿体的reads会被mapping到叶绿体上，从而起到过滤的作用。
                                                                                • +
                                                                              • 如果担心核基因派生的reads影响，可以用一个cutoff值(比如100bp)，小于100bp的mapping被筛除。
                                                                                • +
                                                                              +

                                                                              3.1.2. 把reads往参考序列进行mapping

                                                                                +
                                                                              1. 把reads往参考序列进行mapping，之后再根据mapping的reads的位置进行筛选，筛选出横跨repeat区域的有效mapping。
                                                                                2. +
                                                                              2. 比如repeat长度为220bp，两边各截取300bp，共820bp长度的参考序列。这里把跨越220bp的repeat，并且两边各至少映射上10bp的reads作为有效mapping。这意味着，mapping的起始位置需要小于290，终止位置需要大于530bp。
                                                                                3. +
                                                                              3. bwa进行mapping后得到的bam文件的第4列代表read比对到的参考序列最左侧的位置坐标（未必对上第4列为0）；第9列代表pair read完全匹配到同一条参考序列时，两个read之间的长度。可以理解为insert size。
                                                                                4. +
                                                                              +
                                                                              a = 530 # 设置终止位置需要大于的值，这里是530bp
                                                                              bwa index reference.fa # 为参考序列建立索引
                                                                              bwa mem -t 4 reference.fa  sample_1.clean.fq sample_2.clean.fq | samtools sort -@ 4 -m 4G > reference.bam # 映射reads到参考序列
                                                                              samtools view reference.bam |awk -F"\t" -v awka="$a" '$4<290 && ($4+$9)>awka {print $0}' > reference.bam.filter # 筛选起始位置小于290，终止位置大于530bp的mapped reads。这里的`awk -F"\t"`参数设定列分隔符非常重要，已经坑过我两把了。
                                                                              + +

                                                                              3.1.3. 计算重组率(recombination rate)

                                                                                +
                                                                              1. 把reads往参考序列进行mapping得到有效映射的比对文件reference.bam.filter后，计算不同参考序列的有效映射的reads数量（即数据行数）。
                                                                                2. +
                                                                              2. 重组构象的两条序列(rec_1和rec_2)的比对reads数量之和作为分子，重组构象的两条序列(rec_1和rec_2)的比对reads数量与参考构象的两条序列(ref_1和ref_2)的比对reads数量之和作为分母，两者的比值可作为重组率。
                                                                              -

                                                                              5. references

                                                                                -
                                                                              1. paper：https://www.nature.com/articles/s41467-017-00050-4
                                                                                2. -
                                                                              2. https://mp.weixin.qq.com/s/hp_wxiLDI9EVB8Z3L1bxbw
                                                                                3. -
                                                                              3. https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9959008.html
                                                                                4. +
                                                                                n_ref_1 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "ref_1" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列ref_1上有效映射reads的数量
                                                                                n_ref_2 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "ref_2" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列ref_2上有效映射reads的数量
                                                                                n_rec_1 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "rec_1" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列rec_1上有效映射reads的数量
                                                                                n_rec_2 = $(cat reference.bam.filter | awk '$3 == "rec_2" {print $0}' |wc -l) # 统计参考构象序列rec_2上有效映射reads的数量
                                                                                mapping_rate = $(($n_rec_1+$n_rec_2)/($n_ref_1+$n_ref_2+$n_rec_1+$n_rec_2)) # 计算重组率
                                                                                + +

                                                                                4. references

                                                                                  +
                                                                                1. ROUSFinder.py脚本：https://academic.oup.com/g3journal/article/9/2/549/6026745
                                                                                • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                -]]> +]]> omics - transcriptome + organelle + recombination - RNA-sequencing - RNA-seq - HISAT2 - StringTie - Oases - LoRDEC - STARlong - Salmon-SMEM - DESeq2 - GATK + mitogenome + repeat + recombination + rearrangement + insert size + recombination frequency + ROUSFinder @@ -16690,78 +16695,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 string - - 参考文献管理软件EndNote的中英文混排技巧 - /2023/05/11/tools_academia_EndNote/ - - -

                                                                                1. EndNote的中英文混排

                                                                                1.1. 添加EndNote的【中文文献】类型

                                                                                  -
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【References】，找到【Reference Types】选项；
                                                                                  • -
                                                                                • 【Default Reference Type】选择【unused】1/2/3中的任意一个之前未被修改过的，然后选择【Modify Reference Types】；
                                                                                  • -
                                                                                • 在弹出的【Modify Reference Types】对话框中按照下面的图片输入每项内容。包括【Generic】命名为【中文文献】，【Author】填入【Author】，【Year】填入【Year】，【Title】填入【Title】，【Secondary Author】填入【Secondary Author】，【Secondary Title】要填入【Journal】，【Volume】填入【Volume】，【Number of Volumes】填入【Issue】，【Pages】填入【Pages】，其他都一致，点击【OK】后就添加了【中文文献】的参考文献类型。
                                                                                  • -
                                                                                - - -

                                                                                图 1. Modify Reference Types 对话框 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                -

                                                                                1.2. EndNote的文献目录(Bibliography)的中英文混排

                                                                                1.2.1. 文献目录(Bibliography)的中英文顺序

                                                                                  -
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【Output Styles】-【Edit **】，选择需要编辑的参考文献Styles；
                                                                                  • -
                                                                                • 在【Bibliography】- 【Sort Order】中选择文献目录(Bibliography)的显示排序规则；
                                                                                  • -
                                                                                • 需要英文在前，中文在后的，则选择【Other…】，然后依次选择排序标准，推荐选择【Language】+【Author】+【Title】，然后保存设置。
                                                                                  • -
                                                                                • 注意每一条参考文献的【Language】字段，中文可以设置成【Chinese】，英文设置成【English】或不设置。
                                                                                  • -
                                                                                -

                                                                                1.2.2. 文献目录(Bibliography)的作者的et al. 和**等.**混排

                                                                                  -
                                                                                • 基于已添加【中文文献】类型下操作；
                                                                                  • -
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【Output Styles】-【Edit **】，选择需要编辑的参考文献Styles；
                                                                                  • -
                                                                                • 在【Bibliography】-【Templates】的【Reference Type】中添加【中文文献】的类型；
                                                                                  • -
                                                                                - - -

                                                                                图 2. 在Templates中添加中文文献类型 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                -
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                                                                                • 将【Journal Article】里的参考格式复制到【中文文献】里，再在Author前面加上Secondary，注意Secondary和Author之间打一个空格，显示为一个点.。
                                                                                  • -
                                                                                - - -

                                                                                图 3. 在Templates中添加中文文献类型2 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                -
                                                                                  -
                                                                                • 在【Bibliography】-【Author List】中，对于显示作者人数进行设置，多作者的缩写默认为【，et al.】，这里代表英文文献多作者在文献目录(Bibliography)中的显示规则；
                                                                                  • -
                                                                                • 在【Bibliography】-【Editor List】中，对于显示作者人数进行设置，多作者的缩写改为【，等.】，这里代表中文文献多作者在文献目录(Bibliography)中的显示规则；
                                                                                  • -
                                                                                - - -

                                                                                图 4. 修改中文文献的多作者显示 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                -
                                                                                  -
                                                                                • EndNote导入的中文文献可选择【中文文献】这种类型，然后把【Author】这项内容复制到【Secondary Author】，这样就会遵循【中文文献】的引用的显示规则。
                                                                                  • -
                                                                                -

                                                                                ref：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                -

                                                                                1.3. EndNote的正文引用的中英文混排

                                                                                1.3.1. 作者的et al. 和**等.**混排

                                                                                  -
                                                                                1. 手动修改中文文献的et al.成等.
                                                                                  2. -
                                                                                -
                                                                                  -
                                                                                • 在Word正文的EndNote引用文献(张三 et al. 2023)中右键，选择【edit citations】-【more】；
                                                                                  • -
                                                                                • 然后在【Edit & Manage Citations】对话框中把这一条参考文献的【Formatting】从【Default】改成【Exclude Author】，这样正文会不显示作者；
                                                                                  • -
                                                                                • 继续在【Prefix】中手动添加前缀，这里填写【张三等，】，则正文会显示(张三等，2023);
                                                                                  • -
                                                                                • 依次修改正文中每一条参考文献。
                                                                                  • -
                                                                                -

                                                                                ref：https://www.baishujun.com/archives/7634.html

                                                                                -
                                                                                -
                                                                                  -
                                                                                • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                  • -
                                                                                • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                  • -
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                                                                                1. EndNote的中英文混排

                                                                                1.1. 添加EndNote的【中文文献】类型

                                                                                  +
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【References】，找到【Reference Types】选项；
                                                                                  • +
                                                                                • 【Default Reference Type】选择【unused】1/2/3中的任意一个之前未被修改过的，然后选择【Modify Reference Types】；
                                                                                  • +
                                                                                • 在弹出的【Modify Reference Types】对话框中按照下面的图片输入每项内容。包括【Generic】命名为【中文文献】，【Author】填入【Author】，【Year】填入【Year】，【Title】填入【Title】，【Secondary Author】填入【Secondary Author】，【Secondary Title】要填入【Journal】，【Volume】填入【Volume】，【Number of Volumes】填入【Issue】，【Pages】填入【Pages】，其他都一致，点击【OK】后就添加了【中文文献】的参考文献类型。
                                                                                  • +
                                                                                + + +

                                                                                图 1. Modify Reference Types 对话框 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                +

                                                                                1.2. EndNote的文献目录(Bibliography)的中英文混排

                                                                                1.2.1. 文献目录(Bibliography)的中英文顺序

                                                                                  +
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【Output Styles】-【Edit **】，选择需要编辑的参考文献Styles；
                                                                                  • +
                                                                                • 在【Bibliography】- 【Sort Order】中选择文献目录(Bibliography)的显示排序规则；
                                                                                  • +
                                                                                • 需要英文在前，中文在后的，则选择【Other…】，然后依次选择排序标准，推荐选择【Language】+【Author】+【Title】，然后保存设置。
                                                                                  • +
                                                                                • 注意每一条参考文献的【Language】字段，中文可以设置成【Chinese】，英文设置成【English】或不设置。
                                                                                  • +
                                                                                +

                                                                                1.2.2. 文献目录(Bibliography)的作者的et al. 和**等.**混排

                                                                                  +
                                                                                • 基于已添加【中文文献】类型下操作；
                                                                                  • +
                                                                                • 在EndNote中选择【Edit】-【Output Styles】-【Edit **】，选择需要编辑的参考文献Styles；
                                                                                  • +
                                                                                • 在【Bibliography】-【Templates】的【Reference Type】中添加【中文文献】的类型；
                                                                                  • +
                                                                                + + +

                                                                                图 2. 在Templates中添加中文文献类型 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                • 将【Journal Article】里的参考格式复制到【中文文献】里，再在Author前面加上Secondary，注意Secondary和Author之间打一个空格，显示为一个点.。
                                                                                  • +
                                                                                + + +

                                                                                图 3. 在Templates中添加中文文献类型2 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                • 在【Bibliography】-【Author List】中，对于显示作者人数进行设置，多作者的缩写默认为【，et al.】，这里代表英文文献多作者在文献目录(Bibliography)中的显示规则；
                                                                                  • +
                                                                                • 在【Bibliography】-【Editor List】中，对于显示作者人数进行设置，多作者的缩写改为【，等.】，这里代表中文文献多作者在文献目录(Bibliography)中的显示规则；
                                                                                  • +
                                                                                + + +

                                                                                图 4. 修改中文文献的多作者显示 图源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                • EndNote导入的中文文献可选择【中文文献】这种类型，然后把【Author】这项内容复制到【Secondary Author】，这样就会遵循【中文文献】的引用的显示规则。
                                                                                  • +
                                                                                +

                                                                                ref：https://zhuanlan.zhihu.com/p/312093759

                                                                                +

                                                                                1.3. EndNote的正文引用的中英文混排

                                                                                1.3.1. 作者的et al. 和**等.**混排

                                                                                  +
                                                                                1. 手动修改中文文献的et al.成等.
                                                                                  2. +
                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                • 在Word正文的EndNote引用文献(张三 et al. 2023)中右键，选择【edit citations】-【more】；
                                                                                  • +
                                                                                • 然后在【Edit & Manage Citations】对话框中把这一条参考文献的【Formatting】从【Default】改成【Exclude Author】，这样正文会不显示作者；
                                                                                  • +
                                                                                • 继续在【Prefix】中手动添加前缀，这里填写【张三等，】，则正文会显示(张三等，2023);
                                                                                  • +
                                                                                • 依次修改正文中每一条参考文献。
                                                                                  • +
                                                                                +

                                                                                ref：https://www.baishujun.com/archives/7634.html

                                                                                +
                                                                                +
                                                                                  +
                                                                                • 欢迎关注微信公众号：生信技工
                                                                                  • +
                                                                                • 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。
                                                                                  • +
                                                                                + +]]>                                                                                 + + tools + academia + EndNote + + + tools + EndNote + 中英文混排 + +                                                                                 CSS /2018/06/04/web_CSS/ @@ -16980,6 +16985,38 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 ES6 + + bootstrap + /2018/06/11/web_bootstrap/ + 1. bootstrap简介

      bootstrap是一个用于快速开发web应用和网站的前端框架。
      它能用于开发响应式布局、移动设备优先的web项目。

      +

      2. bootstrap的安装

      需要在html的link标签引入bootstrap的css插件bootstrap.css，并在script标签中引用bootstrap的js插件bootstrap.js(bootstrap的js插件使用需要先引入jQuery)，有两种方式：

      +

      2.0.0.1. 通过CDN（内容分发网络）引用bootstrap，多个CDN可以使用。比如bootCDN。

      2.0.0.2. 在bootstrap中文网下载bootstrap，是一个文件夹，下有css、js、fonts三个目录。

      在link标签中引入文件夹的css目录下的bootstrap.min.css文件

      +

      <link href="css/bootstrap.min.css" rel="stylesheet">

      +

      在script标签中引用文件夹的js目录下的bootstrap.min.js文件(bootstrap的js插件使用需要先引入jQuery)

      +

      3. bootstrap的css

        +

      1. 使用<img src="" class="img-responsive">使图像对响应式布局更友好地支持。

        +
        2. +

      2. Bootstrap 排版、链接样式设置了基本的全局样式。分别是：

        +
          +
        • 为 body 元素设置 background-color: #fff;
          • +
        • 使用 @font-family-base、@font-size-base 和 @line-height-base a变量作为排版的基本参数
          • +
        • 为所有链接设置了基本颜色 @link-color ，并且当链接处于 :hover 状态时才添加下划线
          • +
        • 这些样式都能在 scaffolding.less 文件中找到对应的源码。
          • +
        +
        3. +

      3. 使用normalize.css来建立跨浏览器的一致性。

        +
        4. +

      4. .container 类用于固定宽度并支持响应式布局的容器。.container-fluid 类用于 100% 宽度，占据全部视口（viewport）的容器。

        +
        5. +
      +]]> + + web + + + bootstrap + + flex /2018/06/12/web_flex/ @@ -17084,38 +17121,6 @@ BiocManager的版本与R版本一一对应，安装时如果版本不对会有 flex - - bootstrap - /2018/06/11/web_bootstrap/ - 1. bootstrap简介

      bootstrap是一个用于快速开发web应用和网站的前端框架。
      它能用于开发响应式布局、移动设备优先的web项目。

      -

      2. bootstrap的安装

      需要在html的link标签引入bootstrap的css插件bootstrap.css，并在script标签中引用bootstrap的js插件bootstrap.js(bootstrap的js插件使用需要先引入jQuery)，有两种方式：

      -

      2.0.0.1. 通过CDN（内容分发网络）引用bootstrap，多个CDN可以使用。比如bootCDN。

      2.0.0.2. 在bootstrap中文网下载bootstrap，是一个文件夹，下有css、js、fonts三个目录。

      在link标签中引入文件夹的css目录下的bootstrap.min.css文件

      -

      <link href="css/bootstrap.min.css" rel="stylesheet">

      -

      在script标签中引用文件夹的js目录下的bootstrap.min.js文件(bootstrap的js插件使用需要先引入jQuery)

      -

      3. bootstrap的css

        -

      1. 使用<img src="" class="img-responsive">使图像对响应式布局更友好地支持。

        -
        2. -

      2. Bootstrap 排版、链接样式设置了基本的全局样式。分别是：

        -
          -
        • 为 body 元素设置 background-color: #fff;
          • -
        • 使用 @font-family-base、@font-size-base 和 @line-height-base a变量作为排版的基本参数
          • -
        • 为所有链接设置了基本颜色 @link-color ，并且当链接处于 :hover 状态时才添加下划线
          • -
        • 这些样式都能在 scaffolding.less 文件中找到对应的源码。
          • -
        -
        3. -

      3. 使用normalize.css来建立跨浏览器的一致性。

        -
        4. -

      4. .container 类用于固定宽度并支持响应式布局的容器。.container-fluid 类用于 100% 宽度，占据全部视口（viewport）的容器。

        -
        5. -
      -]]> - - web - - - bootstrap - - glup /2018/06/12/web_gulp/ diff --git a/tags/3s/index.html b/tags/3s/index.html index 3553c62c30..f32985032c 100644 --- a/tags/3s/index.html +++ b/tags/3s/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      3s - 657k + 658k | diff --git a/tags/404-page/index.html b/tags/404-page/index.html index eb8074ee3e..2080007505 100644 --- a/tags/404-page/index.html +++ b/tags/404-page/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      404 page - 657k + 658k | diff --git a/tags/4dtv/index.html b/tags/4dtv/index.html index 1d2a7195dd..838a24856f 100644 --- a/tags/4dtv/index.html +++ b/tags/4dtv/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      4dtv - 657k + 658k | diff --git a/tags/AnnotationForge/index.html b/tags/AnnotationForge/index.html index c4f08119c1..ccab1919cd 100644 --- a/tags/AnnotationForge/index.html +++ b/tags/AnnotationForge/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      AnnotationForge - 657k + 658k | diff --git a/tags/AnnotationHub/index.html b/tags/AnnotationHub/index.html index d6a25ef71a..1fcbb548a2 100644 --- a/tags/AnnotationHub/index.html +++ b/tags/AnnotationHub/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      AnnotationHub - 657k + 658k | diff --git a/tags/Assemblytics/index.html b/tags/Assemblytics/index.html index 9d03bf4fd2..be07d4c889 100644 --- a/tags/Assemblytics/index.html +++ b/tags/Assemblytics/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      Assemblytics - 657k + 658k | diff --git a/tags/BIC/index.html b/tags/BIC/index.html index b1e7d64166..9e92117f9f 100644 --- a/tags/BIC/index.html +++ b/tags/BIC/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      BIC - 657k + 658k | diff --git a/tags/BIOS/index.html b/tags/BIOS/index.html index 5d839afedf..50f6434545 100644 --- a/tags/BIOS/index.html +++ b/tags/BIOS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      BIOS - 657k + 658k | diff --git a/tags/BUSCO/index.html b/tags/BUSCO/index.html index 887cc69015..5393efcfb8 100644 --- a/tags/BUSCO/index.html +++ b/tags/BUSCO/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      BUSCO - 657k + 658k | diff --git a/tags/BUSTED/index.html b/tags/BUSTED/index.html index 7c62bb667e..82d9625651 100644 --- a/tags/BUSTED/index.html +++ b/tags/BUSTED/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      BUSTED - 657k + 658k | diff --git a/tags/BWA/index.html b/tags/BWA/index.html index c16ace7a3b..7ef18664a4 100644 --- a/tags/BWA/index.html +++ b/tags/BWA/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      BWA - 657k + 658k | diff --git a/tags/Bauhinia/index.html b/tags/Bauhinia/index.html index 2f8eed1356..86709a2fb0 100644 --- a/tags/Bauhinia/index.html +++ b/tags/Bauhinia/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Bauhinia - 657k + 658k | diff --git a/tags/Bayesian-information-criterion/index.html b/tags/Bayesian-information-criterion/index.html index f991534976..4003468678 100644 --- a/tags/Bayesian-information-criterion/index.html +++ b/tags/Bayesian-information-criterion/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Bayesian information criterion - 657k + 658k | diff --git a/tags/Bioconductor/index.html b/tags/Bioconductor/index.html index 75bb69107e..8bc04851c8 100644 --- a/tags/Bioconductor/index.html +++ b/tags/Bioconductor/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Bioconductor - 657k + 658k | diff --git a/tags/Boot-Mode/index.html b/tags/Boot-Mode/index.html index 211e929a50..55474f1cea 100644 --- a/tags/Boot-Mode/index.html +++ b/tags/Boot-Mode/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Boot Mode - 657k + 658k | diff --git a/tags/CAFE/index.html b/tags/CAFE/index.html index cd5d8e476d..fc99361eef 100644 --- a/tags/CAFE/index.html +++ b/tags/CAFE/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      CAFE - 657k + 658k | diff --git a/tags/CCS/index.html b/tags/CCS/index.html index eacfe5014e..851f994586 100644 --- a/tags/CCS/index.html +++ b/tags/CCS/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      CCS - 657k + 658k | diff --git a/tags/CDS/index.html b/tags/CDS/index.html index a80163fe87..903b7a4916 100644 --- a/tags/CDS/index.html +++ b/tags/CDS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      CDS - 657k + 658k | diff --git a/tags/CLR/index.html b/tags/CLR/index.html index aba4f9326f..9dd57f2ea9 100644 --- a/tags/CLR/index.html +++ b/tags/CLR/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      CLR - 657k + 658k | diff --git a/tags/CPU/index.html b/tags/CPU/index.html index 38d8034ed1..1db2fe736b 100644 --- a/tags/CPU/index.html +++ b/tags/CPU/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      CPU - 657k + 658k | diff --git a/tags/CRAN/index.html b/tags/CRAN/index.html index 458b8d7031..5cb233b6fe 100644 --- a/tags/CRAN/index.html +++ b/tags/CRAN/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      CRAN - 657k + 658k | diff --git a/tags/CSS/index.html b/tags/CSS/index.html index 455dc6bd2f..0478708aac 100644 --- a/tags/CSS/index.html +++ b/tags/CSS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      CSS - 657k + 658k | diff --git a/tags/Captura/index.html b/tags/Captura/index.html index d6d44fed20..ff9a5bc099 100644 --- a/tags/Captura/index.html +++ b/tags/Captura/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Captura - 657k + 658k | diff --git a/tags/Circos/index.html b/tags/Circos/index.html index 4c7bd3c239..0d48f9774d 100644 --- a/tags/Circos/index.html +++ b/tags/Circos/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Circos - 657k + 658k | diff --git a/tags/Clustal/index.html b/tags/Clustal/index.html index 3b6b0580d8..a8fe6fcf8c 100644 --- a/tags/Clustal/index.html +++ b/tags/Clustal/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Clustal - 657k + 658k | diff --git a/tags/D-sub-n-sub/index.html b/tags/D-sub-n-sub/index.html index bc728c7636..e73a14b819 100644 --- a/tags/D-sub-n-sub/index.html +++ b/tags/D-sub-n-sub/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Dn - 657k + 658k | diff --git a/tags/D-sub-s-sub/index.html b/tags/D-sub-s-sub/index.html index 1a0709cbca..a691f08fdb 100644 --- a/tags/D-sub-s-sub/index.html +++ b/tags/D-sub-s-sub/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Ds - 657k + 658k | diff --git a/tags/DESeq2/index.html b/tags/DESeq2/index.html index b978d85d12..f93354110e 100644 --- a/tags/DESeq2/index.html +++ b/tags/DESeq2/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      DESeq2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/Dsuite/index.html b/tags/Dsuite/index.html index 9be45cd6fb..3fea5ac5f4 100644 --- a/tags/Dsuite/index.html +++ b/tags/Dsuite/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      Dsuite - 657k + 658k | diff --git a/tags/EDTA/index.html b/tags/EDTA/index.html index af2a301ac7..4686775962 100644 --- a/tags/EDTA/index.html +++ b/tags/EDTA/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      EDTA - 657k + 658k | diff --git a/tags/ES6/index.html b/tags/ES6/index.html index 27227e2cba..6c28c7fa64 100644 --- a/tags/ES6/index.html +++ b/tags/ES6/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ES6 - 657k + 658k | diff --git a/tags/EndNote/index.html b/tags/EndNote/index.html index 3e09d83258..56a9d58ba0 100644 --- a/tags/EndNote/index.html +++ b/tags/EndNote/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      EndNote - 657k + 658k | diff --git a/tags/FADE/index.html b/tags/FADE/index.html index 9cc558f0c5..098033a229 100644 --- a/tags/FADE/index.html +++ b/tags/FADE/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      FADE - 657k + 658k | diff --git a/tags/FEL/index.html b/tags/FEL/index.html index 194d0cc945..07c941bcb6 100644 --- a/tags/FEL/index.html +++ b/tags/FEL/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      FEL - 657k + 658k | diff --git a/tags/FUBAR/index.html b/tags/FUBAR/index.html index 9f7d9280d0..6d5a481536 100644 --- a/tags/FUBAR/index.html +++ b/tags/FUBAR/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      FUBAR - 657k + 658k | diff --git a/tags/GATK/index.html b/tags/GATK/index.html index 47f6e2bcf1..f3b229aeb1 100644 --- a/tags/GATK/index.html +++ b/tags/GATK/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GATK - 657k + 658k | diff --git a/tags/GB2sequin/index.html b/tags/GB2sequin/index.html index 0c2a9d238e..ad3773cf64 100644 --- a/tags/GB2sequin/index.html +++ b/tags/GB2sequin/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GB2sequin - 657k + 658k | diff --git a/tags/GCE/index.html b/tags/GCE/index.html index 496fc694cb..26f5a25704 100644 --- a/tags/GCE/index.html +++ b/tags/GCE/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      GCE - 657k + 658k | diff --git a/tags/GFAP/index.html b/tags/GFAP/index.html index d31bc31410..2491809d13 100644 --- a/tags/GFAP/index.html +++ b/tags/GFAP/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GFAP - 657k + 658k | diff --git a/tags/GFF3/index.html b/tags/GFF3/index.html index 55d838a56a..b9f3db087f 100644 --- a/tags/GFF3/index.html +++ b/tags/GFF3/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GFF3 - 657k + 658k | diff --git a/tags/GFF3toolkit/index.html b/tags/GFF3toolkit/index.html index d270e5aeca..12da32b32d 100644 --- a/tags/GFF3toolkit/index.html +++ b/tags/GFF3toolkit/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GFF3toolkit - 657k + 658k | diff --git a/tags/GO/index.html b/tags/GO/index.html index 5c9f55579f..b30446e62d 100644 --- a/tags/GO/index.html +++ b/tags/GO/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GO - 657k + 658k | diff --git a/tags/GOEAST/index.html b/tags/GOEAST/index.html index 4bc1c48651..7aa6a03cd7 100644 --- a/tags/GOEAST/index.html +++ b/tags/GOEAST/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      GOEAST - 657k + 658k | diff --git a/tags/GSEA/index.html b/tags/GSEA/index.html index 67cd81b3e5..c63c7af975 100644 --- a/tags/GSEA/index.html +++ b/tags/GSEA/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      GSEA - 657k + 658k | diff --git a/tags/Gblocks/index.html b/tags/Gblocks/index.html index 351ab40c50..8a90b9aaaa 100644 --- a/tags/Gblocks/index.html +++ b/tags/Gblocks/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      Gblocks - 657k + 658k | diff --git a/tags/GenBank/index.html b/tags/GenBank/index.html index cc83bfc7a9..6569ee66f0 100644 --- a/tags/GenBank/index.html +++ b/tags/GenBank/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      GenBank - 657k + 658k | diff --git a/tags/Genbank2Sequin-py/index.html b/tags/Genbank2Sequin-py/index.html index 1ce3b714b6..64665c4b49 100644 --- a/tags/Genbank2Sequin-py/index.html +++ b/tags/Genbank2Sequin-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Genbank2Sequin.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/GenomeScope/index.html b/tags/GenomeScope/index.html index 8ea066ca77..e5b8d6f8fb 100644 --- a/tags/GenomeScope/index.html +++ b/tags/GenomeScope/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      GenomeScope - 657k + 658k | diff --git a/tags/Hi-C/index.html b/tags/Hi-C/index.html index e570010811..ab1bfda14d 100644 --- a/tags/Hi-C/index.html +++ b/tags/Hi-C/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      Hi-C - 657k + 658k | diff --git a/tags/HiFi/index.html b/tags/HiFi/index.html index fa2c1b4829..4055e2666e 100644 --- a/tags/HiFi/index.html +++ b/tags/HiFi/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      HiFi - 657k + 658k | diff --git a/tags/HiSat2/index.html b/tags/HiSat2/index.html index dacfc83ed1..333a2dce3d 100644 --- a/tags/HiSat2/index.html +++ b/tags/HiSat2/index.html @@ -23,7 +23,7 @@ - + @@ -33,7 +33,7 @@ - + - Tag: HISAT2 | 生信技工 + Tag: HiSat2 | 生信技工 @@ -215,14 +215,14 @@

      生信技工

      -

      HISAT2 +

      HiSat2 Tag

      - 2021 + 2022
      + +
      +
      + +
      + +
      + +
      +
      @@ -383,7 +403,7 @@

      HISAT2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/Hifiasm/index.html b/tags/Hifiasm/index.html index 7991fc5704..7bb817315f 100644 --- a/tags/Hifiasm/index.html +++ b/tags/Hifiasm/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      Hifiasm - 657k + 658k | diff --git a/tags/HyPhy/index.html b/tags/HyPhy/index.html index 084cbc4622..61c6df7e1d 100644 --- a/tags/HyPhy/index.html +++ b/tags/HyPhy/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      HyPhy - 657k + 658k | diff --git a/tags/ILS/index.html b/tags/ILS/index.html index e655999d15..9cfa44a772 100644 --- a/tags/ILS/index.html +++ b/tags/ILS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ILS - 657k + 658k | diff --git a/tags/Indel/index.html b/tags/Indel/index.html index f8c4126b14..c4660ae71e 100644 --- a/tags/Indel/index.html +++ b/tags/Indel/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      Indel - 657k + 658k | diff --git a/tags/Infernal/index.html b/tags/Infernal/index.html index 4f07af57e3..03dffa5e2d 100644 --- a/tags/Infernal/index.html +++ b/tags/Infernal/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Infernal - 657k + 658k | diff --git a/tags/Julia/index.html b/tags/Julia/index.html index 354806916d..088f9227ca 100644 --- a/tags/Julia/index.html +++ b/tags/Julia/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Julia - 657k + 658k | diff --git a/tags/K-sub-A-sub-K-sub-S-sub/index.html b/tags/K-sub-A-sub-K-sub-S-sub/index.html index 18ff0fd745..5cac09dc28 100644 --- a/tags/K-sub-A-sub-K-sub-S-sub/index.html +++ b/tags/K-sub-A-sub-K-sub-S-sub/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      KA/KS - 657k + 658k | diff --git a/tags/K-sub-A-sub/index.html b/tags/K-sub-A-sub/index.html index cb4e5ea88b..09ffe65743 100644 --- a/tags/K-sub-A-sub/index.html +++ b/tags/K-sub-A-sub/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      KA - 657k + 658k | diff --git a/tags/K-sub-S-sub/index.html b/tags/K-sub-S-sub/index.html index 5d96e85bd8..050e69155b 100644 --- a/tags/K-sub-S-sub/index.html +++ b/tags/K-sub-S-sub/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      KS - 657k + 658k | diff --git a/tags/KAT/index.html b/tags/KAT/index.html index 53143bde04..7f41d006e3 100644 --- a/tags/KAT/index.html +++ b/tags/KAT/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      KAT - 657k + 658k | diff --git a/tags/KEGG/index.html b/tags/KEGG/index.html index ed9d5d9988..c2380db7f5 100644 --- a/tags/KEGG/index.html +++ b/tags/KEGG/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      KEGG - 657k + 658k | diff --git a/tags/KMC/index.html b/tags/KMC/index.html index c6ae4be9dc..8168ed2a12 100644 --- a/tags/KMC/index.html +++ b/tags/KMC/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      KMC - 657k + 658k | diff --git a/tags/KOBAS-i/index.html b/tags/KOBAS-i/index.html index bbc15cab36..9a53240d3f 100644 --- a/tags/KOBAS-i/index.html +++ b/tags/KOBAS-i/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      KOBAS-i - 657k + 658k | diff --git a/tags/Ka/index.html b/tags/Ka/index.html index ce03691998..485e7bf5c5 100644 --- a/tags/Ka/index.html +++ b/tags/Ka/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Ka - 657k + 658k | diff --git a/tags/KaKs-Calculator/index.html b/tags/KaKs-Calculator/index.html index 57ff72be22..db8594c690 100644 --- a/tags/KaKs-Calculator/index.html +++ b/tags/KaKs-Calculator/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      KaKs_Calculator - 657k + 658k | diff --git a/tags/KmerGenie/index.html b/tags/KmerGenie/index.html index 4757fe795c..6695acdc53 100644 --- a/tags/KmerGenie/index.html +++ b/tags/KmerGenie/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      KmerGenie - 657k + 658k | diff --git a/tags/Ks/index.html b/tags/Ks/index.html index 259e318904..da649e7865 100644 --- a/tags/Ks/index.html +++ b/tags/Ks/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      Ks - 657k + 658k | diff --git a/tags/LAI/index.html b/tags/LAI/index.html index 0ccce944c2..38989d1cf3 100644 --- a/tags/LAI/index.html +++ b/tags/LAI/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      LAI - 657k + 658k | diff --git a/tags/LTR/index.html b/tags/LTR/index.html index 3c736ab53a..b159991116 100644 --- a/tags/LTR/index.html +++ b/tags/LTR/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      LTR - 657k + 658k | diff --git a/tags/LoRDEC/index.html b/tags/LoRDEC/index.html index f35f5993d7..40bc2af112 100644 --- a/tags/LoRDEC/index.html +++ b/tags/LoRDEC/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      LoRDEC - 657k + 658k | diff --git a/tags/MAFFT/index.html b/tags/MAFFT/index.html index 212bae869c..4f02d039f8 100644 --- a/tags/MAFFT/index.html +++ b/tags/MAFFT/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      MAFFT - 657k + 658k | diff --git a/tags/MCScanX/index.html b/tags/MCScanX/index.html index 797e9b6d49..0275c22812 100644 --- a/tags/MCScanX/index.html +++ b/tags/MCScanX/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MCScanX - 657k + 658k | diff --git a/tags/MCscan/index.html b/tags/MCscan/index.html index a17989a92b..b4acabf82e 100644 --- a/tags/MCscan/index.html +++ b/tags/MCscan/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MCscan - 657k + 658k | diff --git a/tags/MDS/index.html b/tags/MDS/index.html index fa86355832..8c86bb5094 100644 --- a/tags/MDS/index.html +++ b/tags/MDS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MDS - 657k + 658k | diff --git a/tags/MEME/index.html b/tags/MEME/index.html index 38881e5a02..81fb5a720f 100644 --- a/tags/MEME/index.html +++ b/tags/MEME/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MEME - 657k + 658k | diff --git a/tags/ML-tree/index.html b/tags/ML-tree/index.html index c8a27bc996..3a58313384 100644 --- a/tags/ML-tree/index.html +++ b/tags/ML-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ML tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/MSA/index.html b/tags/MSA/index.html index 4e1a6d0230..6b4d679d84 100644 --- a/tags/MSA/index.html +++ b/tags/MSA/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      MSA - 657k + 658k | diff --git a/tags/MSC/index.html b/tags/MSC/index.html index ae5d8ca9aa..208ded8540 100644 --- a/tags/MSC/index.html +++ b/tags/MSC/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MSC - 657k + 658k | diff --git a/tags/MSCquartets/index.html b/tags/MSCquartets/index.html index f422096c9a..dd7fd7fd4e 100644 --- a/tags/MSCquartets/index.html +++ b/tags/MSCquartets/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MSCquartets - 657k + 658k | diff --git a/tags/MUMandCo/index.html b/tags/MUMandCo/index.html index b0f7fb32db..7e71bd3ac1 100644 --- a/tags/MUMandCo/index.html +++ b/tags/MUMandCo/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      MUMandCo - 657k + 658k | diff --git a/tags/MUSCLE/index.html b/tags/MUSCLE/index.html index 50b1b1455a..cfced04816 100644 --- a/tags/MUSCLE/index.html +++ b/tags/MUSCLE/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      MUSCLE - 657k + 658k | diff --git a/tags/Mercator4/index.html b/tags/Mercator4/index.html index b2f4149022..9e2b8bb434 100644 --- a/tags/Mercator4/index.html +++ b/tags/Mercator4/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Mercator4 - 657k + 658k | diff --git a/tags/Multiple-Sequence-Alignment/index.html b/tags/Multiple-Sequence-Alignment/index.html index 8c59d1544c..9d3b4409cf 100644 --- a/tags/Multiple-Sequence-Alignment/index.html +++ b/tags/Multiple-Sequence-Alignment/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      Multiple Sequence Alignment - 657k + 658k | diff --git a/tags/NGS/index.html b/tags/NGS/index.html index bebcb9bb23..00f3e274aa 100644 --- a/tags/NGS/index.html +++ b/tags/NGS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      NGS - 657k + 658k | diff --git a/tags/Nanopore/index.html b/tags/Nanopore/index.html index 315f7a9895..947b28dcb8 100644 --- a/tags/Nanopore/index.html +++ b/tags/Nanopore/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Nanopore - 657k + 658k | diff --git a/tags/OBS-Studio/index.html b/tags/OBS-Studio/index.html index e4ba934a6f..999cec9b3c 100644 --- a/tags/OBS-Studio/index.html +++ b/tags/OBS-Studio/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      OBS Studio - 657k + 658k | diff --git a/tags/ONT/index.html b/tags/ONT/index.html index 6353c14f2d..005bd87a63 100644 --- a/tags/ONT/index.html +++ b/tags/ONT/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ONT - 657k + 658k | diff --git a/tags/ORA/index.html b/tags/ORA/index.html index ad0426b210..ac6f1ebdb2 100644 --- a/tags/ORA/index.html +++ b/tags/ORA/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      ORA - 657k + 658k | diff --git a/tags/Oases/index.html b/tags/Oases/index.html index 129cd6f48b..3b8fefe539 100644 --- a/tags/Oases/index.html +++ b/tags/Oases/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Oases - 657k + 658k | diff --git a/tags/OrthoFinder2/index.html b/tags/OrthoFinder2/index.html index 49186c0bb9..9b72265229 100644 --- a/tags/OrthoFinder2/index.html +++ b/tags/OrthoFinder2/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      OrthoFinder2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/OrthoMCL/index.html b/tags/OrthoMCL/index.html index 8a99ce3688..a520dac1c6 100644 --- a/tags/OrthoMCL/index.html +++ b/tags/OrthoMCL/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      OrthoMCL - 657k + 658k | diff --git a/tags/PAL2NAL/index.html b/tags/PAL2NAL/index.html index eccc6c777d..9835899321 100644 --- a/tags/PAL2NAL/index.html +++ b/tags/PAL2NAL/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PAL2NAL - 657k + 658k | diff --git a/tags/PANNZER2/index.html b/tags/PANNZER2/index.html index 9813664be5..3cd026f027 100644 --- a/tags/PANNZER2/index.html +++ b/tags/PANNZER2/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PANNZER2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/PATH/index.html b/tags/PATH/index.html index 6140588faa..b3510fa3fa 100644 --- a/tags/PATH/index.html +++ b/tags/PATH/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PATH - 657k + 658k | diff --git a/tags/PCR/index.html b/tags/PCR/index.html index 48979f4d32..40716a6dde 100644 --- a/tags/PCR/index.html +++ b/tags/PCR/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PCR - 657k + 658k | diff --git a/tags/PRANK/index.html b/tags/PRANK/index.html index 8101ecb7b0..3679861e7a 100644 --- a/tags/PRANK/index.html +++ b/tags/PRANK/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PRANK - 657k + 658k | diff --git a/tags/PSMC/index.html b/tags/PSMC/index.html index 912ceeabc3..37f51e8655 100644 --- a/tags/PSMC/index.html +++ b/tags/PSMC/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PSMC - 657k + 658k | diff --git a/tags/PacBio/index.html b/tags/PacBio/index.html index 5a9c6011b7..9091e19cf0 100644 --- a/tags/PacBio/index.html +++ b/tags/PacBio/index.html @@ -483,7 +483,7 @@

      PacBio - 657k + 658k | diff --git a/tags/ParaAT/index.html b/tags/ParaAT/index.html index 602c6df014..d0f5bb6f2c 100644 --- a/tags/ParaAT/index.html +++ b/tags/ParaAT/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      ParaAT - 657k + 658k | diff --git a/tags/PhyloNetworks/index.html b/tags/PhyloNetworks/index.html index c5bafdd563..556fccecd8 100644 --- a/tags/PhyloNetworks/index.html +++ b/tags/PhyloNetworks/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      PhyloNetworks - 657k + 658k | diff --git a/tags/PlantTFDB/index.html b/tags/PlantTFDB/index.html index 8f7bddd234..7f8afd7780 100644 --- a/tags/PlantTFDB/index.html +++ b/tags/PlantTFDB/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PlantTFDB - 657k + 658k | diff --git a/tags/PseudogenePipeline/index.html b/tags/PseudogenePipeline/index.html index 9bed059279..78d234d44e 100644 --- a/tags/PseudogenePipeline/index.html +++ b/tags/PseudogenePipeline/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      PseudogenePipeline - 657k + 658k | diff --git a/tags/QUAST/index.html b/tags/QUAST/index.html index 7174ad5a75..bf3caba3e1 100644 --- a/tags/QUAST/index.html +++ b/tags/QUAST/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      QUAST - 657k + 658k | diff --git a/tags/QualiMap/index.html b/tags/QualiMap/index.html index 460bd747f8..7faa72c91a 100644 --- a/tags/QualiMap/index.html +++ b/tags/QualiMap/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      QualiMap - 657k + 658k | diff --git a/tags/Quartet-Sampling/index.html b/tags/Quartet-Sampling/index.html index 3989191588..e60c6e9b6f 100644 --- a/tags/Quartet-Sampling/index.html +++ b/tags/Quartet-Sampling/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Quartet Sampling - 657k + 658k | diff --git a/tags/R-package/index.html b/tags/R-package/index.html index 93e45023fb..e2d1a88701 100644 --- a/tags/R-package/index.html +++ b/tags/R-package/index.html @@ -509,7 +509,7 @@

      R package - 657k + 658k | diff --git a/tags/R-packages/index.html b/tags/R-packages/index.html index 359337546a..ea72b3fd2a 100644 --- a/tags/R-packages/index.html +++ b/tags/R-packages/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      R packages - 657k + 658k | diff --git a/tags/R/index.html b/tags/R/index.html index 3a238f6a49..45a10d84ea 100644 --- a/tags/R/index.html +++ b/tags/R/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      R - 657k + 658k | diff --git a/tags/RAID-Controller/index.html b/tags/RAID-Controller/index.html index 43c0e49cd6..994069a79b 100644 --- a/tags/RAID-Controller/index.html +++ b/tags/RAID-Controller/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RAID Controller - 657k + 658k | diff --git a/tags/RAID/index.html b/tags/RAID/index.html index b0553d9d25..e498fa7276 100644 --- a/tags/RAID/index.html +++ b/tags/RAID/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RAID - 657k + 658k | diff --git a/tags/RELAX/index.html b/tags/RELAX/index.html index 4ca2d741ca..5e79810f6d 100644 --- a/tags/RELAX/index.html +++ b/tags/RELAX/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      RELAX - 657k + 658k | diff --git a/tags/RNA-seq/index.html b/tags/RNA-seq/index.html index d49bc93530..699433479c 100644 --- a/tags/RNA-seq/index.html +++ b/tags/RNA-seq/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RNA-seq - 657k + 658k | diff --git a/tags/RNA-sequencing/index.html b/tags/RNA-sequencing/index.html index 77762ef806..9780f2c31e 100644 --- a/tags/RNA-sequencing/index.html +++ b/tags/RNA-sequencing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RNA-sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/ROUSFinder/index.html b/tags/ROUSFinder/index.html index 95c52b7ecf..ce140eadfc 100644 --- a/tags/ROUSFinder/index.html +++ b/tags/ROUSFinder/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ROUSFinder - 657k + 658k | diff --git a/tags/ROUSFinder2-0-py/index.html b/tags/ROUSFinder2-0-py/index.html index 0529446994..861f989733 100644 --- a/tags/ROUSFinder2-0-py/index.html +++ b/tags/ROUSFinder2-0-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ROUSFinder2.0.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/RSS/index.html b/tags/RSS/index.html index 590fcf3c9b..642ea3379a 100644 --- a/tags/RSS/index.html +++ b/tags/RSS/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RSS - 657k + 658k | diff --git a/tags/RStudio/index.html b/tags/RStudio/index.html index ee4d95bf8c..e5ce859b1a 100644 --- a/tags/RStudio/index.html +++ b/tags/RStudio/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RStudio - 657k + 658k | diff --git a/tags/RepeatMasker/index.html b/tags/RepeatMasker/index.html index 8ab16767bb..b55ec9f81c 100644 --- a/tags/RepeatMasker/index.html +++ b/tags/RepeatMasker/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RepeatMasker - 657k + 658k | diff --git a/tags/RepeatModeler/index.html b/tags/RepeatModeler/index.html index 77231109bd..d0435ac2bf 100644 --- a/tags/RepeatModeler/index.html +++ b/tags/RepeatModeler/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      RepeatModeler - 657k + 658k | diff --git a/tags/Rfam/index.html b/tags/Rfam/index.html index 67ccb1cd0e..d946c55be9 100644 --- a/tags/Rfam/index.html +++ b/tags/Rfam/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Rfam - 657k + 658k | diff --git a/tags/Rldeogram/index.html b/tags/Rldeogram/index.html index 492765c44a..ac5f12da0c 100644 --- a/tags/Rldeogram/index.html +++ b/tags/Rldeogram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Rldeogram - 657k + 658k | diff --git a/tags/Rtools/index.html b/tags/Rtools/index.html index f789446b4d..88aa713efc 100644 --- a/tags/Rtools/index.html +++ b/tags/Rtools/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Rtools - 657k + 658k | diff --git a/tags/SIM3s/index.html b/tags/SIM3s/index.html index bce64f59ec..f42af6869f 100644 --- a/tags/SIM3s/index.html +++ b/tags/SIM3s/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      SIM3s - 657k + 658k | diff --git a/tags/SLAC/index.html b/tags/SLAC/index.html index c67e2d0678..f120b95c24 100644 --- a/tags/SLAC/index.html +++ b/tags/SLAC/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      SLAC - 657k + 658k | diff --git a/tags/SMRT/index.html b/tags/SMRT/index.html index 3ac71c6225..1d21710670 100644 --- a/tags/SMRT/index.html +++ b/tags/SMRT/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      SMRT - 657k + 658k | diff --git a/tags/SNP/index.html b/tags/SNP/index.html index c15009a1eb..18bdc703dc 100644 --- a/tags/SNP/index.html +++ b/tags/SNP/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      SNP - 657k + 658k | diff --git a/tags/STARlong/index.html b/tags/STARlong/index.html index ee17c3d510..f3653b4127 100644 --- a/tags/STARlong/index.html +++ b/tags/STARlong/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      STARlong - 657k + 658k | diff --git a/tags/SV/index.html b/tags/SV/index.html index 80c819f766..00a9c150fb 100644 --- a/tags/SV/index.html +++ b/tags/SV/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      SV - 657k + 658k | diff --git a/tags/Salmon-SMEM/index.html b/tags/Salmon-SMEM/index.html index deb65fe177..173cc8518f 100644 --- a/tags/Salmon-SMEM/index.html +++ b/tags/Salmon-SMEM/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Salmon-SMEM - 657k + 658k | diff --git a/tags/Sequin/index.html b/tags/Sequin/index.html index 2b87f23a1e..061101a6e9 100644 --- a/tags/Sequin/index.html +++ b/tags/Sequin/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Sequin - 657k + 658k | diff --git a/tags/Smudgeplot/index.html b/tags/Smudgeplot/index.html index 82852892a1..0decddc050 100644 --- a/tags/Smudgeplot/index.html +++ b/tags/Smudgeplot/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      Smudgeplot - 657k + 658k | diff --git a/tags/StringTie/index.html b/tags/StringTie/index.html index 18051ecd29..424de776b9 100644 --- a/tags/StringTie/index.html +++ b/tags/StringTie/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      StringTie - 657k + 658k | diff --git a/tags/TGS/index.html b/tags/TGS/index.html index e6ca7908e6..fc014a44c3 100644 --- a/tags/TGS/index.html +++ b/tags/TGS/index.html @@ -483,7 +483,7 @@

      TGS - 657k + 658k | diff --git a/tags/TreeMix/index.html b/tags/TreeMix/index.html index b650437d96..0a915fa87d 100644 --- a/tags/TreeMix/index.html +++ b/tags/TreeMix/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      TreeMix - 657k + 658k | diff --git a/tags/UFBoot/index.html b/tags/UFBoot/index.html index a2371f657e..b1336d15d4 100644 --- a/tags/UFBoot/index.html +++ b/tags/UFBoot/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      UFBoot - 657k + 658k | diff --git a/tags/USB3-0-Extender/index.html b/tags/USB3-0-Extender/index.html index 1c71f55b33..6825217e5f 100644 --- a/tags/USB3-0-Extender/index.html +++ b/tags/USB3-0-Extender/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      USB3.0 Extender - 657k + 658k | diff --git a/tags/UpSetR/index.html b/tags/UpSetR/index.html index 0f0606806b..ff8268a688 100644 --- a/tags/UpSetR/index.html +++ b/tags/UpSetR/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      UpSetR - 657k + 658k | diff --git a/tags/Venn/index.html b/tags/Venn/index.html index b2feac6c00..4cbb316de3 100644 --- a/tags/Venn/index.html +++ b/tags/Venn/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Venn - 657k + 658k | diff --git a/tags/VennDiagram/index.html b/tags/VennDiagram/index.html index 1982a5c94a..00c1da6663 100644 --- a/tags/VennDiagram/index.html +++ b/tags/VennDiagram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      VennDiagram - 657k + 658k | diff --git a/tags/WGD/index.html b/tags/WGD/index.html index cbf9a44cba..3a338c0c9c 100644 --- a/tags/WGD/index.html +++ b/tags/WGD/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      WGD - 657k + 658k | diff --git a/tags/WGDI/index.html b/tags/WGDI/index.html index cb54f778f8..ef0002171d 100644 --- a/tags/WGDI/index.html +++ b/tags/WGDI/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      WGDI - 657k + 658k | diff --git a/tags/Xbox/index.html b/tags/Xbox/index.html index e0bd06041d..d3cadfe888 100644 --- a/tags/Xbox/index.html +++ b/tags/Xbox/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      Xbox - 657k + 658k | diff --git a/tags/aBSREL/index.html b/tags/aBSREL/index.html index 0cb4b8dc39..c1291f243f 100644 --- a/tags/aBSREL/index.html +++ b/tags/aBSREL/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      aBSREL - 657k + 658k | diff --git a/tags/add/index.html b/tags/add/index.html index a321d4fb63..f65d0ce187 100644 --- a/tags/add/index.html +++ b/tags/add/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      add - 657k + 658k | diff --git a/tags/alignment/index.html b/tags/alignment/index.html index c03e672894..fea52f347b 100644 --- a/tags/alignment/index.html +++ b/tags/alignment/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      alignment - 657k + 658k | diff --git a/tags/aln2tbl-legacy-py/index.html b/tags/aln2tbl-legacy-py/index.html index 8b73090919..754eb6c748 100644 --- a/tags/aln2tbl-legacy-py/index.html +++ b/tags/aln2tbl-legacy-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      aln2tbl-legacy.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/aln2tbl-py/index.html b/tags/aln2tbl-py/index.html index bcb591bd38..a9d8762364 100644 --- a/tags/aln2tbl-py/index.html +++ b/tags/aln2tbl-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      aln2tbl.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/amyloplast/index.html b/tags/amyloplast/index.html index 45fd9f66ca..dc5a7c9cd5 100644 --- a/tags/amyloplast/index.html +++ b/tags/amyloplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      amyloplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/analog/index.html b/tags/analog/index.html index 2cd658bfcb..3a4a9c2181 100644 --- a/tags/analog/index.html +++ b/tags/analog/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      analog - 657k + 658k | diff --git a/tags/ape/index.html b/tags/ape/index.html index 709606d5e0..175fb7826f 100644 --- a/tags/ape/index.html +++ b/tags/ape/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ape - 657k + 658k | diff --git a/tags/auto/index.html b/tags/auto/index.html index 04347754e4..7fa61a3757 100644 --- a/tags/auto/index.html +++ b/tags/auto/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      auto - 657k + 658k | diff --git a/tags/awk/index.html b/tags/awk/index.html index 3458caf8c4..20a8736a37 100644 --- a/tags/awk/index.html +++ b/tags/awk/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      awk - 657k + 658k | diff --git a/tags/bam/index.html b/tags/bam/index.html index 146e9985ea..c3c744f036 100644 --- a/tags/bam/index.html +++ b/tags/bam/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      bam - 657k + 658k | diff --git a/tags/bamdst/index.html b/tags/bamdst/index.html index c53fdc1283..0deef4cdc3 100644 --- a/tags/bamdst/index.html +++ b/tags/bamdst/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      bamdst - 657k + 658k | diff --git a/tags/baseML/index.html b/tags/baseML/index.html index f082aa490f..cb1dddd3c1 100644 --- a/tags/baseML/index.html +++ b/tags/baseML/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      baseML - 657k + 658k | diff --git a/tags/batch-run-sh/index.html b/tags/batch-run-sh/index.html index 3715938674..ffd3fffd01 100644 --- a/tags/batch-run-sh/index.html +++ b/tags/batch-run-sh/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      batch_run.sh - 657k + 658k | diff --git a/tags/bifurcated-tree/index.html b/tags/bifurcated-tree/index.html index 9106ee502c..f1581c34fe 100644 --- a/tags/bifurcated-tree/index.html +++ b/tags/bifurcated-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      bifurcated tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/bigz2/index.html b/tags/bigz2/index.html index 5c377fdcfc..6466d1e7e6 100644 --- a/tags/bigz2/index.html +++ b/tags/bigz2/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      bigz2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/bio/index.html b/tags/bio/index.html index 78353f6603..f5f6c3476a 100644 --- a/tags/bio/index.html +++ b/tags/bio/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      bio - 657k + 658k | diff --git a/tags/bioinfo/index.html b/tags/bioinfo/index.html index 6e59350982..e7e4d8f21c 100644 --- a/tags/bioinfo/index.html +++ b/tags/bioinfo/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      bioinfo - 657k + 658k | diff --git a/tags/biosoft/index.html b/tags/biosoft/index.html index 76fa70f252..cd7bc3f427 100644 --- a/tags/biosoft/index.html +++ b/tags/biosoft/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      biosoft - 657k + 658k | diff --git a/tags/biosoft/page/2/index.html b/tags/biosoft/page/2/index.html index 667600a22e..23be05d705 100644 --- a/tags/biosoft/page/2/index.html +++ b/tags/biosoft/page/2/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      biosoft - 657k + 658k | diff --git a/tags/biosoft/page/3/index.html b/tags/biosoft/page/3/index.html index 574eb39c07..37be2a37d6 100644 --- a/tags/biosoft/page/3/index.html +++ b/tags/biosoft/page/3/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      biosoft - 657k + 658k | diff --git a/tags/blog/index.html b/tags/blog/index.html index 77b799d6d9..49c936d415 100644 --- a/tags/blog/index.html +++ b/tags/blog/index.html @@ -449,7 +449,7 @@

      blog - 657k + 658k | diff --git a/tags/bootstrap/index.html b/tags/bootstrap/index.html index a0b9a1a3d8..82aac89d73 100644 --- a/tags/bootstrap/index.html +++ b/tags/bootstrap/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      bootstrap - 657k + 658k | diff --git a/tags/branch-model/index.html b/tags/branch-model/index.html index 2e5d0c8cd1..d11c1a2800 100644 --- a/tags/branch-model/index.html +++ b/tags/branch-model/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      branch model - 657k + 658k | diff --git a/tags/build-website/index.html b/tags/build-website/index.html index 9466ed50ce..41a4bdee29 100644 --- a/tags/build-website/index.html +++ b/tags/build-website/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      build website - 657k + 658k | diff --git a/tags/cache/index.html b/tags/cache/index.html index 8b399f84bd..fe24533a9b 100644 --- a/tags/cache/index.html +++ b/tags/cache/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      cache - 657k + 658k | diff --git a/tags/castor/index.html b/tags/castor/index.html index ad4979f907..eda282eb0e 100644 --- a/tags/castor/index.html +++ b/tags/castor/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      castor - 657k + 658k | diff --git a/tags/chloroplast/index.html b/tags/chloroplast/index.html index ee9e8258a9..eae8fbaff1 100644 --- a/tags/chloroplast/index.html +++ b/tags/chloroplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      chloroplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/chromoplast/index.html b/tags/chromoplast/index.html index 3799b892e8..30c21ad309 100644 --- a/tags/chromoplast/index.html +++ b/tags/chromoplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      chromoplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/chronogram/index.html b/tags/chronogram/index.html index 66415cd799..77655ccc2c 100644 --- a/tags/chronogram/index.html +++ b/tags/chronogram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      chronogram - 657k + 658k | diff --git a/tags/circular-consensus-sequencing/index.html b/tags/circular-consensus-sequencing/index.html index 5f8d552afa..7c2df4a124 100644 --- a/tags/circular-consensus-sequencing/index.html +++ b/tags/circular-consensus-sequencing/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      circular consensus sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/cladistics/index.html b/tags/cladistics/index.html index b3988a1636..e4b7c7e689 100644 --- a/tags/cladistics/index.html +++ b/tags/cladistics/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      cladistics - 657k + 658k | diff --git a/tags/cladogram/index.html b/tags/cladogram/index.html index 6bc3eb5cb8..701c1ca1ef 100644 --- a/tags/cladogram/index.html +++ b/tags/cladogram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      cladogram - 657k + 658k | diff --git a/tags/clusterProfiler/index.html b/tags/clusterProfiler/index.html index 9829955852..55bc48aaa0 100644 --- a/tags/clusterProfiler/index.html +++ b/tags/clusterProfiler/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      clusterProfiler - 657k + 658k | diff --git a/tags/codeML/index.html b/tags/codeML/index.html index 72fe027700..c1ddd9f8b6 100644 --- a/tags/codeML/index.html +++ b/tags/codeML/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      codeML - 657k + 658k | diff --git a/tags/codon/index.html b/tags/codon/index.html index 7485f0e41e..932d10c91a 100644 --- a/tags/codon/index.html +++ b/tags/codon/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      codon - 657k + 658k | diff --git a/tags/colinearity/index.html b/tags/colinearity/index.html index cf52235cfe..262a223cce 100644 --- a/tags/colinearity/index.html +++ b/tags/colinearity/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      colinearity - 657k + 658k | diff --git a/tags/combine/index.html b/tags/combine/index.html index 8f52677fa8..95b60b25df 100644 --- a/tags/combine/index.html +++ b/tags/combine/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      combine - 657k + 658k | diff --git a/tags/command-connector/index.html b/tags/command-connector/index.html index da8f55d78a..7eb8b2ef52 100644 --- a/tags/command-connector/index.html +++ b/tags/command-connector/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      command connector - 657k + 658k | diff --git a/tags/compress/index.html b/tags/compress/index.html index 0908344037..9cf26b420f 100644 --- a/tags/compress/index.html +++ b/tags/compress/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      compress - 657k + 658k | diff --git a/tags/concat-msa-with-differenct-species-sh/index.html b/tags/concat-msa-with-differenct-species-sh/index.html index 19d2edfce0..855591f20d 100644 --- a/tags/concat-msa-with-differenct-species-sh/index.html +++ b/tags/concat-msa-with-differenct-species-sh/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      concat_msa_with_differenct_species.sh - 657k + 658k | diff --git a/tags/concept/index.html b/tags/concept/index.html index 0bac7e9ed9..8839c1e108 100644 --- a/tags/concept/index.html +++ b/tags/concept/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      concept - 657k + 658k | diff --git a/tags/continuous-long-reads/index.html b/tags/continuous-long-reads/index.html index 6983ed0509..f09de6ef2e 100644 --- a/tags/continuous-long-reads/index.html +++ b/tags/continuous-long-reads/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      continuous long reads - 657k + 658k | diff --git a/tags/contraction/index.html b/tags/contraction/index.html index 1d8c8973d6..a6dd66ed97 100644 --- a/tags/contraction/index.html +++ b/tags/contraction/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      contraction - 657k + 658k | diff --git a/tags/crown-groups/index.html b/tags/crown-groups/index.html index f7d32fa9d3..33b1396674 100644 --- a/tags/crown-groups/index.html +++ b/tags/crown-groups/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      crown groups - 657k + 658k | diff --git a/tags/d-sub-N-sub-d-sub-S-sub/index.html b/tags/d-sub-N-sub-d-sub-S-sub/index.html index 1f22480ae0..177fa9a0ec 100644 --- a/tags/d-sub-N-sub-d-sub-S-sub/index.html +++ b/tags/d-sub-N-sub-d-sub-S-sub/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      dN/dS - 657k + 658k | diff --git a/tags/data-preprocessing/index.html b/tags/data-preprocessing/index.html index 91a57d5d39..75f0446e68 100644 --- a/tags/data-preprocessing/index.html +++ b/tags/data-preprocessing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      data preprocessing - 657k + 658k | diff --git a/tags/deletion/index.html b/tags/deletion/index.html index 4c0aa20c78..39ecd9cd9b 100644 --- a/tags/deletion/index.html +++ b/tags/deletion/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      deletion - 657k + 658k | diff --git a/tags/deploy-website/index.html b/tags/deploy-website/index.html index 189ed30421..119d9ca54f 100644 --- a/tags/deploy-website/index.html +++ b/tags/deploy-website/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      deploy website - 657k + 658k | diff --git a/tags/depth/index.html b/tags/depth/index.html index 9ff3fce3ab..81156b5670 100644 --- a/tags/depth/index.html +++ b/tags/depth/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      depth - 657k + 658k | diff --git a/tags/divergence-time/index.html b/tags/divergence-time/index.html index fef43f3abd..67f6a7e545 100644 --- a/tags/divergence-time/index.html +++ b/tags/divergence-time/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      divergence time - 657k + 658k | diff --git a/tags/duplication/index.html b/tags/duplication/index.html index 896f93a11d..3ba11df36b 100644 --- a/tags/duplication/index.html +++ b/tags/duplication/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      duplication - 657k + 658k | diff --git a/tags/dxy/index.html b/tags/dxy/index.html index 1ab5573c6a..dc40084228 100644 --- a/tags/dxy/index.html +++ b/tags/dxy/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      dxy - 657k + 658k | diff --git a/tags/eggnog-mapper/index.html b/tags/eggnog-mapper/index.html index ffb1998fdf..eda2975019 100644 --- a/tags/eggnog-mapper/index.html +++ b/tags/eggnog-mapper/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      eggnog-mapper - 657k + 658k | diff --git a/tags/elaioplast/index.html b/tags/elaioplast/index.html index 4a771605dd..413ec9fa38 100644 --- a/tags/elaioplast/index.html +++ b/tags/elaioplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      elaioplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/enricher/index.html b/tags/enricher/index.html index c1ffc2f2bf..ac9a301bac 100644 --- a/tags/enricher/index.html +++ b/tags/enricher/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      enricher - 657k + 658k | diff --git a/tags/enrichment-analysis/index.html b/tags/enrichment-analysis/index.html index 8349f4eae9..773d8a23da 100644 --- a/tags/enrichment-analysis/index.html +++ b/tags/enrichment-analysis/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      enrichment analysis - 657k + 658k | diff --git a/tags/error/index.html b/tags/error/index.html index 60ab719459..487fb9b9bd 100644 --- a/tags/error/index.html +++ b/tags/error/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      error - 657k + 658k | diff --git a/tags/etioplast/index.html b/tags/etioplast/index.html index 4eec69b7a7..0c819880a1 100644 --- a/tags/etioplast/index.html +++ b/tags/etioplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      etioplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/evolutionary-tree/index.html b/tags/evolutionary-tree/index.html index 5ee611f482..7a8e7de55e 100644 --- a/tags/evolutionary-tree/index.html +++ b/tags/evolutionary-tree/index.html @@ -449,7 +449,7 @@

      evolutionary tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/experiment/index.html b/tags/experiment/index.html index 16720525ac..07864ace20 100644 --- a/tags/experiment/index.html +++ b/tags/experiment/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      experiment - 657k + 658k | diff --git a/tags/extract-intron-info-pl/index.html b/tags/extract-intron-info-pl/index.html index ab296f8efd..7b1703db14 100644 --- a/tags/extract-intron-info-pl/index.html +++ b/tags/extract-intron-info-pl/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      extract_intron_info.pl - 657k + 658k | diff --git a/tags/extract-single-copy-genes-sh/index.html b/tags/extract-single-copy-genes-sh/index.html index 4564383d79..477000069c 100644 --- a/tags/extract-single-copy-genes-sh/index.html +++ b/tags/extract-single-copy-genes-sh/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      extract_single_copy_genes.sh - 657k + 658k | diff --git a/tags/extract/index.html b/tags/extract/index.html index d63d08d824..9557364eb7 100644 --- a/tags/extract/index.html +++ b/tags/extract/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      extract - 657k + 658k | diff --git a/tags/fa/index.html b/tags/fa/index.html index 9a7740557e..42ab885886 100644 --- a/tags/fa/index.html +++ b/tags/fa/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fa - 657k + 658k | diff --git a/tags/facet-plot/index.html b/tags/facet-plot/index.html index 422aab7dc3..070167c1ed 100644 --- a/tags/facet-plot/index.html +++ b/tags/facet-plot/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      facet_plot - 657k + 658k | diff --git a/tags/fai/index.html b/tags/fai/index.html index b3e8a01184..0efca56ac1 100644 --- a/tags/fai/index.html +++ b/tags/fai/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fai - 657k + 658k | diff --git a/tags/faidx/index.html b/tags/faidx/index.html index 56719bf15a..775db177e5 100644 --- a/tags/faidx/index.html +++ b/tags/faidx/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      faidx - 657k + 658k | diff --git a/tags/fas/index.html b/tags/fas/index.html index 5a57b95c95..bd3fcca008 100644 --- a/tags/fas/index.html +++ b/tags/fas/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fas - 657k + 658k | diff --git a/tags/fasta/index.html b/tags/fasta/index.html index d5d7c5101b..a302a953df 100644 --- a/tags/fasta/index.html +++ b/tags/fasta/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      fasta - 657k + 658k | diff --git a/tags/fastq/index.html b/tags/fastq/index.html index 538c62e600..462ccb00b9 100644 --- a/tags/fastq/index.html +++ b/tags/fastq/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fastq - 657k + 658k | diff --git a/tags/flex/index.html b/tags/flex/index.html index e98f92a1bd..d4cb18564a 100644 --- a/tags/flex/index.html +++ b/tags/flex/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      flex - 657k + 658k | diff --git a/tags/for/index.html b/tags/for/index.html index 820087b4d8..ad8803da20 100644 --- a/tags/for/index.html +++ b/tags/for/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      for - 657k + 658k | diff --git a/tags/fossil-time/index.html b/tags/fossil-time/index.html index ab038a7ffd..ea4e5a5eb1 100644 --- a/tags/fossil-time/index.html +++ b/tags/fossil-time/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fossil time - 657k + 658k | diff --git a/tags/fq/index.html b/tags/fq/index.html index 9bff7af9a2..3a63807f4e 100644 --- a/tags/fq/index.html +++ b/tags/fq/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fq - 657k + 658k | diff --git a/tags/fst/index.html b/tags/fst/index.html index 563a294caa..276ffbf0e9 100644 --- a/tags/fst/index.html +++ b/tags/fst/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      fst - 657k + 658k | diff --git a/tags/functional-annotation/index.html b/tags/functional-annotation/index.html index 83b89800d7..8cc05a65e2 100644 --- a/tags/functional-annotation/index.html +++ b/tags/functional-annotation/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      functional annotation - 657k + 658k | diff --git a/tags/gbf2tbl-pl/index.html b/tags/gbf2tbl-pl/index.html index 057697b7ec..ec5f11d759 100644 --- a/tags/gbf2tbl-pl/index.html +++ b/tags/gbf2tbl-pl/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gbf2tbl.pl - 657k + 658k | diff --git a/tags/genbank-to-tbl-py/index.html b/tags/genbank-to-tbl-py/index.html index b404d2b5c3..7db2dd8894 100644 --- a/tags/genbank-to-tbl-py/index.html +++ b/tags/genbank-to-tbl-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      genbank_to_tbl.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/gene-duplication-event/index.html b/tags/gene-duplication-event/index.html index e9fae77179..6017034079 100644 --- a/tags/gene-duplication-event/index.html +++ b/tags/gene-duplication-event/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gene duplication event - 657k + 658k | diff --git a/tags/gene-family/index.html b/tags/gene-family/index.html index 3c34b9ed45..a3cd1e2303 100644 --- a/tags/gene-family/index.html +++ b/tags/gene-family/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      gene family - 657k + 658k | diff --git a/tags/gene-flow/index.html b/tags/gene-flow/index.html index 25e4579499..5f4c4bbcf3 100644 --- a/tags/gene-flow/index.html +++ b/tags/gene-flow/index.html @@ -486,7 +486,7 @@

      gene flow - 657k + 658k | diff --git a/tags/gene-set-enrichment-analysis/index.html b/tags/gene-set-enrichment-analysis/index.html index b73870c4d5..d535765ee9 100644 --- a/tags/gene-set-enrichment-analysis/index.html +++ b/tags/gene-set-enrichment-analysis/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      gene set enrichment analysis - 657k + 658k | diff --git a/tags/gene-tree/index.html b/tags/gene-tree/index.html index afe14f4e27..8dab9efeaa 100644 --- a/tags/gene-tree/index.html +++ b/tags/gene-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gene tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome-annotation/index.html b/tags/genome-annotation/index.html index 78250c7234..305acd9fc2 100644 --- a/tags/genome-annotation/index.html +++ b/tags/genome-annotation/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      genome annotation - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome-assembly/index.html b/tags/genome-assembly/index.html index d0e726ff15..661d034c47 100644 --- a/tags/genome-assembly/index.html +++ b/tags/genome-assembly/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      genome assembly - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome-sequencing/index.html b/tags/genome-sequencing/index.html index 9be14eda4f..48ee4bc976 100644 --- a/tags/genome-sequencing/index.html +++ b/tags/genome-sequencing/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      genome sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome-submit/index.html b/tags/genome-submit/index.html index 3dc8d95ecc..812114fed2 100644 --- a/tags/genome-submit/index.html +++ b/tags/genome-submit/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      genome submit - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome-survey/index.html b/tags/genome-survey/index.html index 1d63584f50..fd1a31e201 100644 --- a/tags/genome-survey/index.html +++ b/tags/genome-survey/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      genome survey - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome/index.html b/tags/genome/index.html index 9c47b41a67..90ce4ef081 100644 --- a/tags/genome/index.html +++ b/tags/genome/index.html @@ -566,7 +566,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome/page/2/index.html b/tags/genome/page/2/index.html index 77cdaa5097..d0e280b6df 100644 --- a/tags/genome/page/2/index.html +++ b/tags/genome/page/2/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/tags/genome/page/3/index.html b/tags/genome/page/3/index.html index fba655e7a8..7246a72645 100644 --- a/tags/genome/page/3/index.html +++ b/tags/genome/page/3/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      genome - 657k + 658k | diff --git a/tags/geom-taxalink/index.html b/tags/geom-taxalink/index.html index 25adbeabde..9b99c49fe7 100644 --- a/tags/geom-taxalink/index.html +++ b/tags/geom-taxalink/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      geom_taxalink - 657k + 658k | diff --git a/tags/gerontoplast/index.html b/tags/gerontoplast/index.html index f64c38b0d1..adaa1c087f 100644 --- a/tags/gerontoplast/index.html +++ b/tags/gerontoplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gerontoplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/get-subtree-with-tips/index.html b/tags/get-subtree-with-tips/index.html index 3b165dec83..a10f8596f1 100644 --- a/tags/get-subtree-with-tips/index.html +++ b/tags/get-subtree-with-tips/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      get_subtree_with_tips - 657k + 658k | diff --git a/tags/ggdensitree/index.html b/tags/ggdensitree/index.html index 692c1be212..55bb2735a0 100644 --- a/tags/ggdensitree/index.html +++ b/tags/ggdensitree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ggdensitree - 657k + 658k | diff --git a/tags/ggplot2/index.html b/tags/ggplot2/index.html index d52f0998ca..1c558a84f8 100644 --- a/tags/ggplot2/index.html +++ b/tags/ggplot2/index.html @@ -429,7 +429,7 @@

      ggplot2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/ggstance/index.html b/tags/ggstance/index.html index 9aec671845..2e52ffa5b0 100644 --- a/tags/ggstance/index.html +++ b/tags/ggstance/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ggstance - 657k + 658k | diff --git a/tags/ggtree/index.html b/tags/ggtree/index.html index c1d8342dac..0381a9859d 100644 --- a/tags/ggtree/index.html +++ b/tags/ggtree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ggtree - 657k + 658k | diff --git a/tags/github/index.html b/tags/github/index.html index 2769877d95..cc21902bbd 100644 --- a/tags/github/index.html +++ b/tags/github/index.html @@ -449,7 +449,7 @@

      github - 657k + 658k | diff --git a/tags/gplots/index.html b/tags/gplots/index.html index c77ae6de98..3aa814c3e8 100644 --- a/tags/gplots/index.html +++ b/tags/gplots/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gplots - 657k + 658k | diff --git a/tags/groupadd/index.html b/tags/groupadd/index.html index 8d2ad1b4d5..c8e1f7338c 100644 --- a/tags/groupadd/index.html +++ b/tags/groupadd/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      groupadd - 657k + 658k | diff --git a/tags/groupdel/index.html b/tags/groupdel/index.html index 71e7bba15b..758a055687 100644 --- a/tags/groupdel/index.html +++ b/tags/groupdel/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      groupdel - 657k + 658k | diff --git a/tags/groupmod/index.html b/tags/groupmod/index.html index 3f24008a5c..f56cb18c04 100644 --- a/tags/groupmod/index.html +++ b/tags/groupmod/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      groupmod - 657k + 658k | diff --git a/tags/gulp/index.html b/tags/gulp/index.html index 7bae254c2d..ba896c37ee 100644 --- a/tags/gulp/index.html +++ b/tags/gulp/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gulp - 657k + 658k | diff --git a/tags/gzip/index.html b/tags/gzip/index.html index 56947c57e1..2440c3bc55 100644 --- a/tags/gzip/index.html +++ b/tags/gzip/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      gzip - 657k + 658k | diff --git a/tags/hardware/index.html b/tags/hardware/index.html index e53039bf22..a32d6b72a8 100644 --- a/tags/hardware/index.html +++ b/tags/hardware/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      hardware - 657k + 658k | diff --git a/tags/heatmap/index.html b/tags/heatmap/index.html index f4d1ecd4f9..fc120b0d9d 100644 --- a/tags/heatmap/index.html +++ b/tags/heatmap/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      heatmap - 657k + 658k | diff --git a/tags/hexo/index.html b/tags/hexo/index.html index 69332b9dad..f5836723f3 100644 --- a/tags/hexo/index.html +++ b/tags/hexo/index.html @@ -472,7 +472,7 @@

      hexo - 657k + 658k | diff --git a/tags/homolog/index.html b/tags/homolog/index.html index 70476f23e8..548e443700 100644 --- a/tags/homolog/index.html +++ b/tags/homolog/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      homolog - 657k + 658k | diff --git a/tags/html/index.html b/tags/html/index.html index cd9756600d..6717463942 100644 --- a/tags/html/index.html +++ b/tags/html/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      html - 657k + 658k | diff --git a/tags/hybridization/index.html b/tags/hybridization/index.html index 7be93b4d63..9746922818 100644 --- a/tags/hybridization/index.html +++ b/tags/hybridization/index.html @@ -486,7 +486,7 @@

      hybridization - 657k + 658k | diff --git a/tags/ideogram/index.html b/tags/ideogram/index.html index 2217ebbff3..cc675a9b11 100644 --- a/tags/ideogram/index.html +++ b/tags/ideogram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ideogram - 657k + 658k | diff --git a/tags/image/index.html b/tags/image/index.html index 9d30cf46af..5ef381709b 100644 --- a/tags/image/index.html +++ b/tags/image/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      image - 657k + 658k | diff --git a/tags/index.html b/tags/index.html index 774c78b8af..a036b01dc0 100644 --- a/tags/index.html +++ b/tags/index.html @@ -390,7 +390,7 @@

      tags - 657k + 658k | diff --git a/tags/insert-size/index.html b/tags/insert-size/index.html index 91eb87bf56..4fe28126b9 100644 --- a/tags/insert-size/index.html +++ b/tags/insert-size/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      insert size - 657k + 658k | diff --git a/tags/insertion/index.html b/tags/insertion/index.html index f208985707..64c8bdbd91 100644 --- a/tags/insertion/index.html +++ b/tags/insertion/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      insertion - 657k + 658k | diff --git a/tags/interproscan/index.html b/tags/interproscan/index.html index e10a3bf170..483e942358 100644 --- a/tags/interproscan/index.html +++ b/tags/interproscan/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      interproscan - 657k + 658k | diff --git a/tags/introgressive/index.html b/tags/introgressive/index.html index 0e89e2e5bf..b545c54c07 100644 --- a/tags/introgressive/index.html +++ b/tags/introgressive/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      introgressive - 657k + 658k | diff --git a/tags/inversion/index.html b/tags/inversion/index.html index c7a44d08ec..1489209155 100644 --- a/tags/inversion/index.html +++ b/tags/inversion/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      inversion - 657k + 658k | diff --git a/tags/iqtree2/index.html b/tags/iqtree2/index.html index e618d9817e..e0655ee4a3 100644 --- a/tags/iqtree2/index.html +++ b/tags/iqtree2/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      iqtree2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/itol/index.html b/tags/itol/index.html index f7527641f9..9674aaadd0 100644 --- a/tags/itol/index.html +++ b/tags/itol/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      itol - 657k + 658k | diff --git a/tags/jcvi/index.html b/tags/jcvi/index.html index b33aa43435..3653afac0b 100644 --- a/tags/jcvi/index.html +++ b/tags/jcvi/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      jcvi - 657k + 658k | diff --git a/tags/jellyfish/index.html b/tags/jellyfish/index.html index fff0d6bf4e..16459b195e 100644 --- a/tags/jellyfish/index.html +++ b/tags/jellyfish/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      jellyfish - 657k + 658k | diff --git a/tags/jquery/index.html b/tags/jquery/index.html index 193506ef1f..1340e6225a 100644 --- a/tags/jquery/index.html +++ b/tags/jquery/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      jquery - 657k + 658k | diff --git a/tags/k-mer/index.html b/tags/k-mer/index.html index 34af63bbfd..08f53cabbe 100644 --- a/tags/k-mer/index.html +++ b/tags/k-mer/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      k-mer - 657k + 658k | diff --git a/tags/kmerfreq/index.html b/tags/kmerfreq/index.html index 4b710361c7..9302664c60 100644 --- a/tags/kmerfreq/index.html +++ b/tags/kmerfreq/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      kmerfreq - 657k + 658k | diff --git a/tags/leucoplast/index.html b/tags/leucoplast/index.html index 36a363bae0..4e92223008 100644 --- a/tags/leucoplast/index.html +++ b/tags/leucoplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      leucoplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/line-separator/index.html b/tags/line-separator/index.html index 8ddd825330..ca65a08eb1 100644 --- a/tags/line-separator/index.html +++ b/tags/line-separator/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      line separator - 657k + 658k | diff --git a/tags/linux/index.html b/tags/linux/index.html index fe5d1c86e8..4da17f262c 100644 --- a/tags/linux/index.html +++ b/tags/linux/index.html @@ -509,7 +509,7 @@

      linux - 657k + 658k | diff --git a/tags/load-average/index.html b/tags/load-average/index.html index f950257941..083f5e7a7a 100644 --- a/tags/load-average/index.html +++ b/tags/load-average/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      load average - 657k + 658k | diff --git a/tags/log/index.html b/tags/log/index.html index 915e7151d6..78638a368e 100644 --- a/tags/log/index.html +++ b/tags/log/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      log - 657k + 658k | diff --git a/tags/long-read-sequencing/index.html b/tags/long-read-sequencing/index.html index 4255fa713b..b39b754d4c 100644 --- a/tags/long-read-sequencing/index.html +++ b/tags/long-read-sequencing/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      long read sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/loop/index.html b/tags/loop/index.html index 8306cf8d0c..6b2eb5cd84 100644 --- a/tags/loop/index.html +++ b/tags/loop/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      loop - 657k + 658k | diff --git a/tags/mapping-rate/index.html b/tags/mapping-rate/index.html index 5619b37b7e..78859b4535 100644 --- a/tags/mapping-rate/index.html +++ b/tags/mapping-rate/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mapping rate - 657k + 658k | diff --git a/tags/mapping/index.html b/tags/mapping/index.html index dac98bc859..74d139dd05 100644 --- a/tags/mapping/index.html +++ b/tags/mapping/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      mapping - 657k + 658k | diff --git a/tags/markdown/index.html b/tags/markdown/index.html index 0db1dcbad0..01b0697cd4 100644 --- a/tags/markdown/index.html +++ b/tags/markdown/index.html @@ -426,7 +426,7 @@

      markdown - 657k + 658k | diff --git a/tags/maximum-likelihood-tree/index.html b/tags/maximum-likelihood-tree/index.html index e7d9e62008..574169c6a7 100644 --- a/tags/maximum-likelihood-tree/index.html +++ b/tags/maximum-likelihood-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      maximum likelihood tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/mcmctree/index.html b/tags/mcmctree/index.html index 79be9f3bba..bd8551982d 100644 --- a/tags/mcmctree/index.html +++ b/tags/mcmctree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mcmctree - 657k + 658k | diff --git a/tags/merge/index.html b/tags/merge/index.html index 6b118895af..f1d9ac7125 100644 --- a/tags/merge/index.html +++ b/tags/merge/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      merge - 657k + 658k | diff --git a/tags/minimap2/index.html b/tags/minimap2/index.html index 93d53a9e91..d4b2047f12 100644 --- a/tags/minimap2/index.html +++ b/tags/minimap2/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      minimap2 - 657k + 658k | diff --git a/tags/mitogenome/index.html b/tags/mitogenome/index.html index 424ecf1307..603bd8043b 100644 --- a/tags/mitogenome/index.html +++ b/tags/mitogenome/index.html @@ -486,7 +486,7 @@

      mitogenome - 657k + 658k | diff --git a/tags/mitogenomics/index.html b/tags/mitogenomics/index.html index b413217ba4..5938141351 100644 --- a/tags/mitogenomics/index.html +++ b/tags/mitogenomics/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mitogenomics - 657k + 658k | diff --git a/tags/mitos2fasta-py/index.html b/tags/mitos2fasta-py/index.html index 005076cba0..a6f730a188 100644 --- a/tags/mitos2fasta-py/index.html +++ b/tags/mitos2fasta-py/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mitos2fasta.py - 657k + 658k | diff --git a/tags/molecular-experiment/index.html b/tags/molecular-experiment/index.html index 1f6e0d64e0..fb0aadb513 100644 --- a/tags/molecular-experiment/index.html +++ b/tags/molecular-experiment/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      molecular experiment - 657k + 658k | diff --git a/tags/monophyly/index.html b/tags/monophyly/index.html index 1561debff4..5bb850f77a 100644 --- a/tags/monophyly/index.html +++ b/tags/monophyly/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      monophyly - 657k + 658k | diff --git a/tags/mosdepth/index.html b/tags/mosdepth/index.html index 777dbbfb5d..66e720e5cd 100644 --- a/tags/mosdepth/index.html +++ b/tags/mosdepth/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mosdepth - 657k + 658k | diff --git a/tags/mount/index.html b/tags/mount/index.html index e9cc656a20..1d37cc9e68 100644 --- a/tags/mount/index.html +++ b/tags/mount/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      mount - 657k + 658k | diff --git a/tags/multi-transcriptome-assembly-with-ref-sh/index.html b/tags/multi-transcriptome-assembly-with-ref-sh/index.html index d4d4e36965..579b7e0357 100644 --- a/tags/multi-transcriptome-assembly-with-ref-sh/index.html +++ b/tags/multi-transcriptome-assembly-with-ref-sh/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      multi-transcriptome_assembly_with_ref.sh - 657k + 658k | diff --git a/tags/multiPhylo/index.html b/tags/multiPhylo/index.html index b93c5542a8..933d448b53 100644 --- a/tags/multiPhylo/index.html +++ b/tags/multiPhylo/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      multiPhylo - 657k + 658k | diff --git a/tags/multidimensional-scaling/index.html b/tags/multidimensional-scaling/index.html index a8d7a7280f..030203acf5 100644 --- a/tags/multidimensional-scaling/index.html +++ b/tags/multidimensional-scaling/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      multidimensional scaling - 657k + 658k | diff --git a/tags/music/index.html b/tags/music/index.html index c238a74f42..ab8fd7b8c9 100644 --- a/tags/music/index.html +++ b/tags/music/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      music - 657k + 658k | diff --git a/tags/ncRNA/index.html b/tags/ncRNA/index.html index 44bf60440b..f586f3f1d4 100644 --- a/tags/ncRNA/index.html +++ b/tags/ncRNA/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ncRNA - 657k + 658k | diff --git a/tags/negative-selection/index.html b/tags/negative-selection/index.html index a5424d07c8..6930532a87 100644 --- a/tags/negative-selection/index.html +++ b/tags/negative-selection/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      negative selection - 657k + 658k | diff --git a/tags/neutral-selection/index.html b/tags/neutral-selection/index.html index 64bfd09c74..b5833cb104 100644 --- a/tags/neutral-selection/index.html +++ b/tags/neutral-selection/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      neutral selection - 657k + 658k | diff --git a/tags/newgrp/index.html b/tags/newgrp/index.html index 3711742bfc..e181e92d54 100644 --- a/tags/newgrp/index.html +++ b/tags/newgrp/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      newgrp - 657k + 658k | diff --git a/tags/next-generation-sequencing/index.html b/tags/next-generation-sequencing/index.html index 0c36d04867..e06ba5deb9 100644 --- a/tags/next-generation-sequencing/index.html +++ b/tags/next-generation-sequencing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      next generation sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/next/index.html b/tags/next/index.html index 42961728f3..fd7d68f698 100644 --- a/tags/next/index.html +++ b/tags/next/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      next - 657k + 658k | diff --git "a/tags/omega-\317\211/index.html" "b/tags/omega-\317\211/index.html" index f4e4f759d7..b42172689d 100644 --- "a/tags/omega-\317\211/index.html" +++ "b/tags/omega-\317\211/index.html" @@ -423,7 +423,7 @@

      omega(ω) - 657k + 658k | diff --git a/tags/omega/index.html b/tags/omega/index.html index 7fae07e675..26836edfb7 100644 --- a/tags/omega/index.html +++ b/tags/omega/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      omega - 657k + 658k | diff --git a/tags/organellar-genome/index.html b/tags/organellar-genome/index.html index 0e995960c9..2d4d481c88 100644 --- a/tags/organellar-genome/index.html +++ b/tags/organellar-genome/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      organellar genome - 657k + 658k | diff --git a/tags/organelle/index.html b/tags/organelle/index.html index 35451e2271..27a484593f 100644 --- a/tags/organelle/index.html +++ b/tags/organelle/index.html @@ -463,7 +463,7 @@

      organelle - 657k + 658k | diff --git a/tags/orthogroup/index.html b/tags/orthogroup/index.html index 0e0d3b69fb..5d3169d7bc 100644 --- a/tags/orthogroup/index.html +++ b/tags/orthogroup/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      orthogroup - 657k + 658k | diff --git a/tags/ortholog/index.html b/tags/ortholog/index.html index cc1b9d56d3..b4185dc8f7 100644 --- a/tags/ortholog/index.html +++ b/tags/ortholog/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ortholog - 657k + 658k | diff --git a/tags/orthology/index.html b/tags/orthology/index.html index 02a8bcf26b..b2deb64cfe 100644 --- a/tags/orthology/index.html +++ b/tags/orthology/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      orthology - 657k + 658k | diff --git a/tags/over-representation-analysis/index.html b/tags/over-representation-analysis/index.html index d6570e882f..b73e190af9 100644 --- a/tags/over-representation-analysis/index.html +++ b/tags/over-representation-analysis/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      over representation analysis - 657k + 658k | diff --git a/tags/paml/index.html b/tags/paml/index.html index 357bb9ae63..8fbd87cf93 100644 --- a/tags/paml/index.html +++ b/tags/paml/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      PAML - 657k + 658k | diff --git a/tags/paralog/index.html b/tags/paralog/index.html index 030e1c25ff..b15d9d82ff 100644 --- a/tags/paralog/index.html +++ b/tags/paralog/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      paralog - 657k + 658k | diff --git a/tags/paraphyly/index.html b/tags/paraphyly/index.html index 969cfaef50..4974f90135 100644 --- a/tags/paraphyly/index.html +++ b/tags/paraphyly/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      paraphyly - 657k + 658k | diff --git a/tags/passwd/index.html b/tags/passwd/index.html index 8a2ef2bdde..7f1ee43b75 100644 --- a/tags/passwd/index.html +++ b/tags/passwd/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      passwd - 657k + 658k | diff --git a/tags/paste/index.html b/tags/paste/index.html index 4d0c13a6f0..576fea89c6 100644 --- a/tags/paste/index.html +++ b/tags/paste/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      paste - 657k + 658k | diff --git a/tags/pheatmap/index.html b/tags/pheatmap/index.html index 56b80fb5ec..06dd314d3d 100644 --- a/tags/pheatmap/index.html +++ b/tags/pheatmap/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pheatmap - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogenetic-discordance/index.html b/tags/phylogenetic-discordance/index.html index 4531c9aebf..d682f8120a 100644 --- a/tags/phylogenetic-discordance/index.html +++ b/tags/phylogenetic-discordance/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogenetic discordance - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogenetic-reticulum/index.html b/tags/phylogenetic-reticulum/index.html index bb4b2706de..68001d00de 100644 --- a/tags/phylogenetic-reticulum/index.html +++ b/tags/phylogenetic-reticulum/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogenetic reticulum - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogenetic-tree/index.html b/tags/phylogenetic-tree/index.html index 27ae5dbc8e..ae99beb6f4 100644 --- a/tags/phylogenetic-tree/index.html +++ b/tags/phylogenetic-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogenetic tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogenomics/index.html b/tags/phylogenomics/index.html index 16ff5dc0ef..1e3e47c96f 100644 --- a/tags/phylogenomics/index.html +++ b/tags/phylogenomics/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogenomics - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogeny-inference/index.html b/tags/phylogeny-inference/index.html index 3e6991695d..ec151c9281 100644 --- a/tags/phylogeny-inference/index.html +++ b/tags/phylogeny-inference/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogeny inference - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogeny/index.html b/tags/phylogeny/index.html index 5c6abf1abc..9ce98edec7 100644 --- a/tags/phylogeny/index.html +++ b/tags/phylogeny/index.html @@ -549,7 +549,7 @@

      phylogeny - 657k + 658k | diff --git a/tags/phylogram/index.html b/tags/phylogram/index.html index cf4c014f32..3d677fc5e0 100644 --- a/tags/phylogram/index.html +++ b/tags/phylogram/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      phylogram - 657k + 658k | diff --git a/tags/pi/index.html b/tags/pi/index.html index 83b6af38b9..9271616d74 100644 --- a/tags/pi/index.html +++ b/tags/pi/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pi - 657k + 658k | diff --git a/tags/pigz/index.html b/tags/pigz/index.html index 575be5a253..9648f5f99f 100644 --- a/tags/pigz/index.html +++ b/tags/pigz/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pigz - 657k + 658k | diff --git a/tags/pixy/index.html b/tags/pixy/index.html index 4dc1d39e4d..29090db768 100644 --- a/tags/pixy/index.html +++ b/tags/pixy/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pixy - 657k + 658k | diff --git a/tags/plastid/index.html b/tags/plastid/index.html index aaee87a4a5..8ff65e9373 100644 --- a/tags/plastid/index.html +++ b/tags/plastid/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      plastid - 657k + 658k | diff --git a/tags/plastome/index.html b/tags/plastome/index.html index 1c95eab717..9441e54f48 100644 --- a/tags/plastome/index.html +++ b/tags/plastome/index.html @@ -443,7 +443,7 @@

      plastome - 657k + 658k | diff --git a/tags/plot/index.html b/tags/plot/index.html index 089afb31ed..7e6210832d 100644 --- a/tags/plot/index.html +++ b/tags/plot/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      plot - 657k + 658k | diff --git a/tags/polyphyly/index.html b/tags/polyphyly/index.html index 2b050d0eed..20ccd0d6f9 100644 --- a/tags/polyphyly/index.html +++ b/tags/polyphyly/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      polyphyly - 657k + 658k | diff --git a/tags/population-networks/index.html b/tags/population-networks/index.html index f9a84d458a..efcf7a79bb 100644 --- a/tags/population-networks/index.html +++ b/tags/population-networks/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      population networks - 657k + 658k | diff --git a/tags/positive-selection/index.html b/tags/positive-selection/index.html index 5fe26f54b7..231c1efd4a 100644 --- a/tags/positive-selection/index.html +++ b/tags/positive-selection/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      positive selection - 657k + 658k | diff --git a/tags/proplastid/index.html b/tags/proplastid/index.html index 75b3b46fe3..c68f533c61 100644 --- a/tags/proplastid/index.html +++ b/tags/proplastid/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      proplastid - 657k + 658k | diff --git a/tags/protein/index.html b/tags/protein/index.html index 9c1e6c9cc6..79967dc171 100644 --- a/tags/protein/index.html +++ b/tags/protein/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      protein - 657k + 658k | diff --git a/tags/proteinoplast/index.html b/tags/proteinoplast/index.html index f4e4efafd6..4ec9ea6e45 100644 --- a/tags/proteinoplast/index.html +++ b/tags/proteinoplast/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      proteinoplast - 657k + 658k | diff --git a/tags/pseudogene/index.html b/tags/pseudogene/index.html index 49d035ea3c..967e545037 100644 --- a/tags/pseudogene/index.html +++ b/tags/pseudogene/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      pseudogene - 657k + 658k | diff --git a/tags/purifying-selection/index.html b/tags/purifying-selection/index.html index 947b840046..c229957d0b 100644 --- a/tags/purifying-selection/index.html +++ b/tags/purifying-selection/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      purifying selection - 657k + 658k | diff --git a/tags/python/index.html b/tags/python/index.html index 6ea3d15e5a..85546257ec 100644 --- a/tags/python/index.html +++ b/tags/python/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      python - 657k + 658k | diff --git a/tags/quality-assessment/index.html b/tags/quality-assessment/index.html index 4a775d75d8..be99ecf42b 100644 --- a/tags/quality-assessment/index.html +++ b/tags/quality-assessment/index.html @@ -569,7 +569,7 @@

      quality assessment - 657k + 658k | diff --git a/tags/quality-assessment/page/2/index.html b/tags/quality-assessment/page/2/index.html index b0850913d5..cff8d5e782 100644 --- a/tags/quality-assessment/page/2/index.html +++ b/tags/quality-assessment/page/2/index.html @@ -386,7 +386,7 @@

      quality assessment - 657k + 658k | diff --git a/tags/quote/index.html b/tags/quote/index.html index 81ed2767e4..9e9d4ed21b 100644 --- a/tags/quote/index.html +++ b/tags/quote/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      quote - 657k + 658k | diff --git a/tags/quotes/index.html b/tags/quotes/index.html index b8b47be6f3..f2f86f8eef 100644 --- a/tags/quotes/index.html +++ b/tags/quotes/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      quotes - 657k + 658k | diff --git a/tags/r8s/index.html b/tags/r8s/index.html index d2b670e366..0992e88bba 100644 --- a/tags/r8s/index.html +++ b/tags/r8s/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      r8s - 657k + 658k | diff --git a/tags/rar/index.html b/tags/rar/index.html index e1ab01925f..5794943475 100644 --- a/tags/rar/index.html +++ b/tags/rar/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      rar - 657k + 658k | diff --git a/tags/react/index.html b/tags/react/index.html index 93248f0990..a3e16c52bb 100644 --- a/tags/react/index.html +++ b/tags/react/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      react - 657k + 658k | diff --git a/tags/readme/index.html b/tags/readme/index.html index 62cf97a748..eb49a6197d 100644 --- a/tags/readme/index.html +++ b/tags/readme/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      readme - 657k + 658k | diff --git a/tags/rearrangement/index.html b/tags/rearrangement/index.html index a75e067d74..e25cc1934f 100644 --- a/tags/rearrangement/index.html +++ b/tags/rearrangement/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      rearrangement - 657k + 658k | diff --git a/tags/reciprocal-cross/index.html b/tags/reciprocal-cross/index.html index 014fd66345..793eba09a1 100644 --- a/tags/reciprocal-cross/index.html +++ b/tags/reciprocal-cross/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      reciprocal cross - 657k + 658k | diff --git a/tags/recombination-frequency/index.html b/tags/recombination-frequency/index.html index f9d8203073..40f04d1251 100644 --- a/tags/recombination-frequency/index.html +++ b/tags/recombination-frequency/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      recombination frequency - 657k + 658k | diff --git a/tags/recombination/index.html b/tags/recombination/index.html index 8a209febe2..7f137944bc 100644 --- a/tags/recombination/index.html +++ b/tags/recombination/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      recombination - 657k + 658k | diff --git a/tags/reinstall/index.html b/tags/reinstall/index.html index 641e612581..85de7eebb8 100644 --- a/tags/reinstall/index.html +++ b/tags/reinstall/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      reinstall - 657k + 658k | diff --git a/tags/rename/index.html b/tags/rename/index.html index 1f143e1d0c..28e4698e7a 100644 --- a/tags/rename/index.html +++ b/tags/rename/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      rename - 657k + 658k | diff --git a/tags/repeat-contraction/index.html b/tags/repeat-contraction/index.html index 03442b6ff9..8b1535fd78 100644 --- a/tags/repeat-contraction/index.html +++ b/tags/repeat-contraction/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      repeat contraction - 657k + 658k | diff --git a/tags/repeat-expansion/index.html b/tags/repeat-expansion/index.html index a4b8621025..2800fd21b8 100644 --- a/tags/repeat-expansion/index.html +++ b/tags/repeat-expansion/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      repeat expansion - 657k + 658k | diff --git a/tags/repeat-sequences/index.html b/tags/repeat-sequences/index.html index 7bfe038c3a..4c9bc09662 100644 --- a/tags/repeat-sequences/index.html +++ b/tags/repeat-sequences/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      repeat sequences - 657k + 658k | diff --git a/tags/repeat/index.html b/tags/repeat/index.html index a97c8b43bd..95fcd27cc5 100644 --- a/tags/repeat/index.html +++ b/tags/repeat/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      repeat - 657k + 658k | diff --git a/tags/resume/index.html b/tags/resume/index.html index 39adef9cf7..7cf08e276a 100644 --- a/tags/resume/index.html +++ b/tags/resume/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      resume - 657k + 658k | diff --git a/tags/sam/index.html b/tags/sam/index.html index ddf2929f58..8f09104f0f 100644 --- a/tags/sam/index.html +++ b/tags/sam/index.html @@ -503,7 +503,7 @@

      sam - 657k + 658k | diff --git a/tags/samtools-flagstat/index.html b/tags/samtools-flagstat/index.html index 1c1ce87590..53352d0c10 100644 --- a/tags/samtools-flagstat/index.html +++ b/tags/samtools-flagstat/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      samtools flagstat - 657k + 658k | diff --git a/tags/samtools/index.html b/tags/samtools/index.html index aa2d61046e..40d93286ba 100644 --- a/tags/samtools/index.html +++ b/tags/samtools/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      samtools - 657k + 658k | diff --git a/tags/sanger-sequencing/index.html b/tags/sanger-sequencing/index.html index 27cf9d54c4..8ba516cdec 100644 --- a/tags/sanger-sequencing/index.html +++ b/tags/sanger-sequencing/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      sanger sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/screen-recorder/index.html b/tags/screen-recorder/index.html index 570621b8b4..e4273f1a7b 100644 --- a/tags/screen-recorder/index.html +++ b/tags/screen-recorder/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      screen recorder - 657k + 658k | diff --git a/tags/scripts/index.html b/tags/scripts/index.html index 6cb6151c24..968e90052d 100644 --- a/tags/scripts/index.html +++ b/tags/scripts/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      scripts - 657k + 658k | diff --git a/tags/sed/index.html b/tags/sed/index.html index df18c862ad..3646a07f4d 100644 --- a/tags/sed/index.html +++ b/tags/sed/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      sed - 657k + 658k | diff --git a/tags/selection/index.html b/tags/selection/index.html index b5860eb807..1de831f3d1 100644 --- a/tags/selection/index.html +++ b/tags/selection/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      selection - 657k + 658k | diff --git a/tags/sequence-alignment/index.html b/tags/sequence-alignment/index.html index 96d04897a1..1153a2e809 100644 --- a/tags/sequence-alignment/index.html +++ b/tags/sequence-alignment/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      sequence alignment - 657k + 658k | diff --git a/tags/server/index.html b/tags/server/index.html index 2fa7fd2295..12997622b9 100644 --- a/tags/server/index.html +++ b/tags/server/index.html @@ -466,7 +466,7 @@

      server - 657k + 658k | diff --git a/tags/shell/index.html b/tags/shell/index.html index f0a65e566c..b8a177c951 100644 --- a/tags/shell/index.html +++ b/tags/shell/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      shell - 657k + 658k | diff --git a/tags/simplex/index.html b/tags/simplex/index.html index 3ce08474a0..7535513080 100644 --- a/tags/simplex/index.html +++ b/tags/simplex/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      simplex - 657k + 658k | diff --git a/tags/sort/index.html b/tags/sort/index.html index ccaec23c37..a75fcbcf10 100644 --- a/tags/sort/index.html +++ b/tags/sort/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      sort - 657k + 658k | diff --git a/tags/species-tree/index.html b/tags/species-tree/index.html index 82360c2aa5..aed6dc7acb 100644 --- a/tags/species-tree/index.html +++ b/tags/species-tree/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      species tree - 657k + 658k | diff --git a/tags/stem-groups/index.html b/tags/stem-groups/index.html index 7a46e647c6..cff8baa44e 100644 --- a/tags/stem-groups/index.html +++ b/tags/stem-groups/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      stem groups - 657k + 658k | diff --git a/tags/string/index.html b/tags/string/index.html index 7a35b32ca6..78ee59ac1e 100644 --- a/tags/string/index.html +++ b/tags/string/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      string - 657k + 658k | diff --git a/tags/structural-variation/index.html b/tags/structural-variation/index.html index 9eaa9b77db..791551fbf0 100644 --- a/tags/structural-variation/index.html +++ b/tags/structural-variation/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      structural variation - 657k + 658k | diff --git a/tags/submit/index.html b/tags/submit/index.html index 8548db8b0b..0a982dfea7 100644 --- a/tags/submit/index.html +++ b/tags/submit/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      submit - 657k + 658k | diff --git a/tags/subreads/index.html b/tags/subreads/index.html index 97f85db045..8ff730938c 100644 --- a/tags/subreads/index.html +++ b/tags/subreads/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      subreads - 657k + 658k | diff --git a/tags/sync/index.html b/tags/sync/index.html index 8cfd519bb7..9263c19904 100644 --- a/tags/sync/index.html +++ b/tags/sync/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      sync - 657k + 658k | diff --git a/tags/syntax/index.html b/tags/syntax/index.html index ef07a342e5..bd045734d8 100644 --- a/tags/syntax/index.html +++ b/tags/syntax/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      syntax - 657k + 658k | diff --git a/tags/synteny/index.html b/tags/synteny/index.html index 3f6643fc08..c5d4981769 100644 --- a/tags/synteny/index.html +++ b/tags/synteny/index.html @@ -446,7 +446,7 @@

      synteny - 657k + 658k | diff --git a/tags/system/index.html b/tags/system/index.html index 2281dfe4e9..c84c41b0e5 100644 --- a/tags/system/index.html +++ b/tags/system/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      system - 657k + 658k | diff --git a/tags/table2asn/index.html b/tags/table2asn/index.html index ccfff7818b..2ad381e8e3 100644 --- a/tags/table2asn/index.html +++ b/tags/table2asn/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      table2asn - 657k + 658k | diff --git a/tags/tandem-contraction/index.html b/tags/tandem-contraction/index.html index 4f8cee4625..63a97b8d38 100644 --- a/tags/tandem-contraction/index.html +++ b/tags/tandem-contraction/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      tandem contraction - 657k + 658k | diff --git a/tags/tandem-expansion/index.html b/tags/tandem-expansion/index.html index cec1569a92..95a3743562 100644 --- a/tags/tandem-expansion/index.html +++ b/tags/tandem-expansion/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      tandem expansion - 657k + 658k | diff --git a/tags/tandem-repeat/index.html b/tags/tandem-repeat/index.html index 9f81cf327c..7466c8b575 100644 --- a/tags/tandem-repeat/index.html +++ b/tags/tandem-repeat/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      tandem repeat - 657k + 658k | diff --git a/tags/tar/index.html b/tags/tar/index.html index e492da6a4d..f2f714c38c 100644 --- a/tags/tar/index.html +++ b/tags/tar/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      tar - 657k + 658k | diff --git a/tags/tbl/index.html b/tags/tbl/index.html index 0e9f3d48e6..b2b128d870 100644 --- a/tags/tbl/index.html +++ b/tags/tbl/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      tbl - 657k + 658k | diff --git a/tags/tbl2asn/index.html b/tags/tbl2asn/index.html index 6a39c64162..fb92aa4a43 100644 --- a/tags/tbl2asn/index.html +++ b/tags/tbl2asn/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      tbl2asn - 657k + 658k | diff --git a/tags/third-generation-sequencing/index.html b/tags/third-generation-sequencing/index.html index e66338baf5..6d88a84588 100644 --- a/tags/third-generation-sequencing/index.html +++ b/tags/third-generation-sequencing/index.html @@ -483,7 +483,7 @@

      third generation sequencing - 657k + 658k | diff --git a/tags/tools/index.html b/tags/tools/index.html index a42c3930d1..7a3b883d19 100644 --- a/tags/tools/index.html +++ b/tags/tools/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      tools - 657k + 658k | diff --git a/tags/top/index.html b/tags/top/index.html index eda81899f0..483ebe2841 100644 --- a/tags/top/index.html +++ b/tags/top/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      top - 657k + 658k | diff --git a/tags/topGO/index.html b/tags/topGO/index.html index 725ab0bdff..3e74411fdd 100644 --- a/tags/topGO/index.html +++ b/tags/topGO/index.html @@ -403,7 +403,7 @@

      topGO - 657k + 658k | diff --git a/tags/tr/index.html b/tags/tr/index.html index c26cf94a13..8430b2ac58 100644 --- a/tags/tr/index.html +++ b/tags/tr/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      tr - 657k + 658k | diff --git a/tags/transcription-factor/index.html b/tags/transcription-factor/index.html index 05b890a63a..35610d9964 100644 --- a/tags/transcription-factor/index.html +++ b/tags/transcription-factor/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      transcription factor - 657k + 658k | diff --git a/tags/transcriptome/index.html b/tags/transcriptome/index.html index e34d94db95..cf890991d1 100644 --- a/tags/transcriptome/index.html +++ b/tags/transcriptome/index.html @@ -423,7 +423,7 @@

      transcriptome - 657k + 658k | diff --git a/tags/translocation/index.html b/tags/translocation/index.html index f6d63d659f..ed7cba0d30 100644 --- a/tags/translocation/index.html +++ b/tags/translocation/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      translocation - 657k + 658k | diff --git a/tags/transposable-elements-TE/index.html b/tags/transposable-elements-TE/index.html index 623ed1aa62..19802458ab 100644 --- a/tags/transposable-elements-TE/index.html +++ b/tags/transposable-elements-TE/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      transposable elements(TE) - 657k + 658k | diff --git a/tags/treeio/index.html b/tags/treeio/index.html index 8bce7603bc..f2b1a0c1bd 100644 --- a/tags/treeio/index.html +++ b/tags/treeio/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      treeio - 657k + 658k | diff --git a/tags/trimAl/index.html b/tags/trimAl/index.html index 8ca20d0ea6..d606694f75 100644 --- a/tags/trimAl/index.html +++ b/tags/trimAl/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      trimAl - 657k + 658k | diff --git a/tags/trimming/index.html b/tags/trimming/index.html index 89fd944fe4..d00cc029b5 100644 --- a/tags/trimming/index.html +++ b/tags/trimming/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      trimming - 657k + 658k | diff --git a/tags/tutorial/index.html b/tags/tutorial/index.html index cd2b062916..470a35821d 100644 --- a/tags/tutorial/index.html +++ b/tags/tutorial/index.html @@ -429,7 +429,7 @@

      tutorial - 657k + 658k | diff --git a/tags/ultrafast-bootstrap-approximation/index.html b/tags/ultrafast-bootstrap-approximation/index.html index 738560af9d..0a0c09eacf 100644 --- a/tags/ultrafast-bootstrap-approximation/index.html +++ b/tags/ultrafast-bootstrap-approximation/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      ultrafast bootstrap approximation - 657k + 658k | diff --git a/tags/user/index.html b/tags/user/index.html index a99c501de0..1bc8ffd65c 100644 --- a/tags/user/index.html +++ b/tags/user/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      user - 657k + 658k | diff --git a/tags/useradd/index.html b/tags/useradd/index.html index 03d8a3dc3c..acba916d41 100644 --- a/tags/useradd/index.html +++ b/tags/useradd/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      useradd - 657k + 658k | diff --git a/tags/userdel/index.html b/tags/userdel/index.html index 7a921f11a5..fe0bdea41c 100644 --- a/tags/userdel/index.html +++ b/tags/userdel/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      userdel - 657k + 658k | diff --git a/tags/usermod/index.html b/tags/usermod/index.html index 84a0f0b43c..8593a37b7f 100644 --- a/tags/usermod/index.html +++ b/tags/usermod/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      usermod - 657k + 658k | diff --git a/tags/variation/index.html b/tags/variation/index.html index f07ccde6c0..a8f1f94613 100644 --- a/tags/variation/index.html +++ b/tags/variation/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      variation - 657k + 658k | diff --git a/tags/video/index.html b/tags/video/index.html index 6bb2afa53a..2034168d87 100644 --- a/tags/video/index.html +++ b/tags/video/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      video - 657k + 658k | diff --git a/tags/visualization/index.html b/tags/visualization/index.html index 2259c6c52a..981b759b9b 100644 --- a/tags/visualization/index.html +++ b/tags/visualization/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      visualization - 657k + 658k | diff --git a/tags/website-maintenance/index.html b/tags/website-maintenance/index.html index a4de3c250e..fcbbf4b427 100644 --- a/tags/website-maintenance/index.html +++ b/tags/website-maintenance/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      website maintenance - 657k + 658k | diff --git a/tags/while/index.html b/tags/while/index.html index e06f3b3bdc..47566344a3 100644 --- a/tags/while/index.html +++ b/tags/while/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      while - 657k + 658k | diff --git a/tags/windows/index.html b/tags/windows/index.html index 83f74be6ec..123cf81a75 100644 --- a/tags/windows/index.html +++ b/tags/windows/index.html @@ -406,7 +406,7 @@

      Windows - 657k + 658k | diff --git a/tags/xargs/index.html b/tags/xargs/index.html index 787093720f..464ae76cd5 100644 --- a/tags/xargs/index.html +++ b/tags/xargs/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      xargs - 657k + 658k | diff --git a/tags/xenolog/index.html b/tags/xenolog/index.html index e74cf7333e..a2ea3118f2 100644 --- a/tags/xenolog/index.html +++ b/tags/xenolog/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      xenolog - 657k + 658k | diff --git a/tags/zip/index.html b/tags/zip/index.html index e39626a453..69ebb81cdb 100644 --- a/tags/zip/index.html +++ b/tags/zip/index.html @@ -383,7 +383,7 @@

      zip - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\317\211/index.html" "b/tags/\317\211/index.html" index b0ccffa08e..c8d3c7ac1c 100644 --- "a/tags/\317\211/index.html" +++ "b/tags/\317\211/index.html" @@ -423,7 +423,7 @@

      ω - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\344\270\255\350\213\261\346\226\207\346\267\267\346\216\222/index.html" "b/tags/\344\270\255\350\213\261\346\226\207\346\267\267\346\216\222/index.html" index 34779a0d9d..fa80e24b9e 100644 --- "a/tags/\344\270\255\350\213\261\346\226\207\346\267\267\346\216\222/index.html" +++ "b/tags/\344\270\255\350\213\261\346\226\207\346\267\267\346\216\222/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      中英文混排 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\344\274\274\347\204\266\346\257\224\346\243\200\351\252\214-LRT/index.html" "b/tags/\344\274\274\347\204\266\346\257\224\346\243\200\351\252\214-LRT/index.html" index dc08206dfb..27ec423dad 100644 --- "a/tags/\344\274\274\347\204\266\346\257\224\346\243\200\351\252\214-LRT/index.html" +++ "b/tags/\344\274\274\347\204\266\346\257\224\346\243\200\351\252\214-LRT/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      似然比检验(LRT) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-site-model/index.html" "b/tags/\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-site-model/index.html" index d8484291e0..17d4ad7ce3 100644 --- "a/tags/\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-site-model/index.html" +++ "b/tags/\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-site-model/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      位点模型 (site model) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\201\207\345\237\272\345\233\240/index.html" "b/tags/\345\201\207\345\237\272\345\233\240/index.html" index db21477faa..817b1f911e 100644 --- "a/tags/\345\201\207\345\237\272\345\233\240/index.html" +++ "b/tags/\345\201\207\345\237\272\345\233\240/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      假基因 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\210\206\346\224\257\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-branch-site-model/index.html" "b/tags/\345\210\206\346\224\257\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-branch-site-model/index.html" index 09dd437b9b..36aa6984e2 100644 --- "a/tags/\345\210\206\346\224\257\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-branch-site-model/index.html" +++ "b/tags/\345\210\206\346\224\257\344\275\215\347\202\271\346\250\241\345\236\213-branch-site-model/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      分支位点模型 (branch-site model) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\210\206\346\224\257\346\250\241\345\236\213-branch-model/index.html" "b/tags/\345\210\206\346\224\257\346\250\241\345\236\213-branch-model/index.html" index 2620885d5c..05a6e071a2 100644 --- "a/tags/\345\210\206\346\224\257\346\250\241\345\236\213-branch-model/index.html" +++ "b/tags/\345\210\206\346\224\257\346\250\241\345\236\213-branch-model/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      分支模型 (branch model) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\215\241\346\226\271\346\243\200\351\252\214-chi2-test/index.html" "b/tags/\345\215\241\346\226\271\346\243\200\351\252\214-chi2-test/index.html" index 01cdf04ac6..6ea8bda8bf 100644 --- "a/tags/\345\215\241\346\226\271\346\243\200\351\252\214-chi2-test/index.html" +++ "b/tags/\345\215\241\346\226\271\346\243\200\351\252\214-chi2-test/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      卡方检验(chi2 test) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\216\237\350\264\250\344\275\223/index.html" "b/tags/\345\216\237\350\264\250\344\275\223/index.html" index 65f75e4265..75520cde8b 100644 --- "a/tags/\345\216\237\350\264\250\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\345\216\237\350\264\250\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      原质体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\345\217\266\347\273\277\344\275\223/index.html" "b/tags/\345\217\266\347\273\277\344\275\223/index.html" index 1b7dc3c35a..7781fc9a2b 100644 --- "a/tags/\345\217\266\347\273\277\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\345\217\266\347\273\277\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      叶绿体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\346\210\220\345\257\271Robinson-Foulds\350\267\235\347\246\273/index.html" "b/tags/\346\210\220\345\257\271Robinson-Foulds\350\267\235\347\246\273/index.html" index 0d1ff3c7cc..e78a66454b 100644 --- "a/tags/\346\210\220\345\257\271Robinson-Foulds\350\267\235\347\246\273/index.html" +++ "b/tags/\346\210\220\345\257\271Robinson-Foulds\350\267\235\347\246\273/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      成对Robinson-Foulds距离 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\346\240\270\345\277\203/index.html" "b/tags/\346\240\270\345\277\203/index.html" index ad7e1b7f76..933d589bde 100644 --- "a/tags/\346\240\270\345\277\203/index.html" +++ "b/tags/\346\240\270\345\277\203/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      核心 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\347\211\251\347\220\206CPU/index.html" "b/tags/\347\211\251\347\220\206CPU/index.html" index bd3946d1bd..bdc92465d5 100644 --- "a/tags/\347\211\251\347\220\206CPU/index.html" +++ "b/tags/\347\211\251\347\220\206CPU/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      物理CPU - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\347\231\275\350\264\250\344\275\223/index.html" "b/tags/\347\231\275\350\264\250\344\275\223/index.html" index 97d676189c..e1a4155983 100644 --- "a/tags/\347\231\275\350\264\250\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\347\231\275\350\264\250\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      白质体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\347\245\226\345\205\210\347\212\266\346\200\201\351\207\215\345\273\272/index.html" "b/tags/\347\245\226\345\205\210\347\212\266\346\200\201\351\207\215\345\273\272/index.html" index 79bfa3f5cc..9bae6b5af9 100644 --- "a/tags/\347\245\226\345\205\210\347\212\266\346\200\201\351\207\215\345\273\272/index.html" +++ "b/tags/\347\245\226\345\205\210\347\212\266\346\200\201\351\207\215\345\273\272/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      祖先状态重建 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\350\200\201\345\271\264\344\275\223/index.html" "b/tags/\350\200\201\345\271\264\344\275\223/index.html" index 5caf92d4e1..56c1b4faac 100644 --- "a/tags/\350\200\201\345\271\264\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\350\200\201\345\271\264\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      老年体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\350\211\262\350\264\250\344\275\223/index.html" "b/tags/\350\211\262\350\264\250\344\275\223/index.html" index dd443f7443..673834f5ee 100644 --- "a/tags/\350\211\262\350\264\250\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\350\211\262\350\264\250\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      色质体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\350\264\250\344\275\223/index.html" "b/tags/\350\264\250\344\275\223/index.html" index a3e7467858..bf58ee95fd 100644 --- "a/tags/\350\264\250\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\350\264\250\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      质体 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\350\277\220\347\273\264/index.html" "b/tags/\350\277\220\347\273\264/index.html" index e802f22054..48f0070e63 100644 --- "a/tags/\350\277\220\347\273\264/index.html" +++ "b/tags/\350\277\220\347\273\264/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      运维 - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\350\277\233\345\214\226\346\236\235\346\250\241\345\236\213-clade-model/index.html" "b/tags/\350\277\233\345\214\226\346\236\235\346\250\241\345\236\213-clade-model/index.html" index b8b934aac2..48268c70fa 100644 --- "a/tags/\350\277\233\345\214\226\346\236\235\346\250\241\345\236\213-clade-model/index.html" +++ "b/tags/\350\277\233\345\214\226\346\236\235\346\250\241\345\236\213-clade-model/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      进化枝模型 (clade model) - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\351\200\273\350\276\221CPU/index.html" "b/tags/\351\200\273\350\276\221CPU/index.html" index 8fa6ab9a1d..84db8fb521 100644 --- "a/tags/\351\200\273\350\276\221CPU/index.html" +++ "b/tags/\351\200\273\350\276\221CPU/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      逻辑CPU - 657k + 658k | diff --git "a/tags/\351\273\204\345\214\226\344\275\223/index.html" "b/tags/\351\273\204\345\214\226\344\275\223/index.html" index cbde16ef34..18b9b70830 100644 --- "a/tags/\351\273\204\345\214\226\344\275\223/index.html" +++ "b/tags/\351\273\204\345\214\226\344\275\223/index.html" @@ -383,7 +383,7 @@

      黄化体 - 657k + 658k |